摘要：目的针对肝纤维化发病关键基因热休克蛋白47(HSP47)基因构建HSP47-shRNA,初步验证其在NIH/3T3细胞系干预HSP47基因的表达,影响HSP47 mRNA及蛋白水平表达,并观察该细胞功能学变化。方法设计HSP47-shRNA模板,并将其分别设计于U6启动子的下游引物,将U6启动子及其下游HSP47-shRNA的模板双链DNA连接入载体,构建HSP47-pGCsi-U6-shRNA重组质粒(HSP47-1-pGCsi-U6-shRNA、HSP47-2-pGCsi-U6-shRNA和HSP47-3-pGCsi-U6-shRNA)。以非相关干扰质粒作为对照,通过脂质体介导转染HSP47-shRNA至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中,分别于12、24、48和72h在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率和荧光表达强度;同时于转染后0、24和48h收集细胞,采用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析HSP47 mRNA和蛋白表达情况;并观察干预后该细胞分泌胶原功能和小鼠转化生长因子(TGF-β1)表达的变化。结果成功构建HSP47-shRNA载体,通过脂质体介导转染入NIH/3T3细胞,各干扰质粒转染效率均约为60.0%,各干扰质粒转染效率间差异无统计学意义(P>0.05)。转染12 h,可见少量绿色荧光细胞,随转染时间的延长,细胞荧光表达量逐渐增加,各干扰质粒于转染72h荧光表达最强。shRNA干扰显著抑制HSP47蛋白的表达,以转染HSP47-1-shRNA 24h后对蛋白表达抑制效果最佳,对HSP47 mRNA的相对沉默效率为(25.83±1.79)%,与空白组及非相关对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。各组HSP47-shRNA干扰质粒对TGF-β1 mRNA的抑制效率以转染24 h效果最佳,相对表达分别为(63.23±2.18)%、(64.53±3.17)%和(75.19±4.20)%,均低于空白组和非相关对照组(P0.05)。各HSP47-shRNA干扰质粒组细胞上清中TGF-β1的抑制率以转染24h为最佳,分别为(51.79±3.12)%、(66.67±2.13)%和(69.61±3.65)%,与空白组相比,HSP47-1-shRNA组与HSP47-2-shRNA组对TGF-β1均有显著抑制作用,且以HSP47-1-shRNA组抑制效率更佳(P0.05)。结论构建了HSP47-shRNA干扰质粒,初步证实其对HSP47的表达干预有效,并引起NIH/3T3细胞功能学的变化。

摘要：目的构建一种可以同时靶向抑制VEGFR2和EGFR分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果。方法通过Overlap PCR的方法通过柔性肽G4S将雷莫芦单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建入工程载体,并通过毕赤酵母表达体系进行表达纯化,获得同时靶向VEGFR2和EGFR的双特异性单链抗体(scDb),命名为VE-scDb;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和VEGFR2过表达的结直肠癌细胞系HT-29的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对HT-29细胞的靶向能力;建立HT-29荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体VE-scDb,经Western blot鉴定验证了VE-scDb表达及装配正确。流式细胞术检测VE-scDb与结直肠癌细胞HT-29的结合率为50.1%,与亲本雷莫芦单抗(55.0%)与西妥昔单抗结合率(53.2%)相当。体外靶向性实验验证VE-scDb可以在体外很好的靶向结直肠癌细胞系HT-29,VE-scDb组的细胞平均荧光强度为97.24±6.72,明显优于阻断对照组(26.29±3.02)(P<0.01)。通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤检验,VE-scDb组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(73.70±6.16)%,明显优于亲本雷莫芦单抗(44.80±5.91)%和西妥昔单抗组(37.75±14.04)%(P<0.01)。结论本文采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体VE-scDb。VE-scDb具有良好的体外肿瘤靶向性,并可能有效的抑制结直肠癌细胞HT-29的体内外增殖。该设计为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景。

摘要：目的建立一种快速的多重聚合酶链反应(PCR)方法,用于检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性,同时对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的种进行鉴定。方法对临床分离的武汉地区金黄色葡萄球菌80株,表皮葡萄球菌70株,其余凝固酶阴性葡萄球菌60株,提取其基因组DNA,针对金黄色葡萄球菌独有的femA基因,表皮葡萄球菌的种特异性序列,决定葡萄球菌对甲氧西林耐药性的mecA基因,和细菌共有的16srRNA基因的保守序列设计四对引物,同时加入PCR体系中对相应片段进行扩增。结果在210株葡萄球菌中,mecA基因检测结果与苯唑西林敏感试验结果的一致率为96.2%。mecA基因阳性但苯唑西林敏感的5个菌株,通过由低到高浓度的苯唑西林筛选培养后,均表现出耐药性。mecA基因阴性但苯唑西林耐药的3个菌株,经过对阿莫西林-克拉维酸敏感性试验后,被证明是β-内酰胺酶的高产株。结论此多重PCR方法不仅可以对临床分离葡萄球菌菌株的甲氧西林耐药性作出判断,同时还可以对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌做出种的鉴定,是一种高效、敏感、特异性高的检测技术。