摘要：目的:研究小RNA干扰泛素特异肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响。方法:设计并合成针对USP22基因的3条特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体Translipid转染EJ细胞。通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后EJ细胞中USP22mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果:3条针对USP22基因的特异性siRNA均能抑制USP22mRNA和蛋白的表达,其中USP22-siRNA-1的沉默效率最高。转染USP22-siRNA-148h后,EJ细胞中USP22mRNA和蛋白表达水平分别下调65%和80%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期。结论:USP22特异性siRNA能够有效沉默USP22基因表达,并显著抑制膀胱癌EJ细胞增殖。推测USP22基因可能成为治疗膀胱癌的一个新靶点。

摘要：目的评价术前CT尿路成像（CTU）三维重建结合术中X线和B超实时引导穿刺建立通道，采用EMS系统行经皮肾镜碎石术（PCNL）的“一站式”诊疗方案在复杂性肾结石中的应用价值。方法回顾性分析华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科2008年12月至2011年12月收治的210例复杂肾结石患者临床资料，其中119例纳入“一站式”方案诊疗组，术前行CTU及三维重建规划设计穿刺路径，采用B超和X线实时引导穿刺建立通道，应用EMS系统行经皮肾镜碎石术。余91例术中无X线监测行经皮肾镜碎石术病例纳为对照组，统计分析两组间1次穿刺成功率、平均通道建立时间、平均手术时间、术中平均出血量及I期结石清除率等指标。术后随访至2012年6月。结果“一站式”方案诊疗组1次穿刺成功率98．3％（117／119），高于对照组92．3％（84／91），差异有统计学意义（P=0．037），手术时间（97．8±13．2）rain较对照组（110．0±14．7）min缩短（P=0．043），且I期结石清除率92．4％（110／119）较对照组83．5％（76／91）高（P=0．037）。两组平均通道建立时间分别为（15．3±3．7）min和（13．9±3．9）min、术中平均出血量分别为（195．8±84．2）ml和（263．3±82．1）ml，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。两组均无严晕并发症发生，随访期间未见结石复发。结论CTU三维罩建结合X线、B超引导建立通道行PCNL的“一站式”诊疗方案，有助于规划最佳手术路径，提高穿刺成功率和I期结石清除率，减少穿刺和手术并发症。

摘要：目的探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA（siRNA）、人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响。方法根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列，分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列（pRNAT—TR—Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ），构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置***—Ⅲ、pRNAT—TERT—Ⅲ（脂质体法）并将其转染BIU-87细胞株，采用荧光定量PCR分析hTR及hTERTmRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖。结果分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后，pRNAT—TERT—Ⅲ，pRNAT—TR-Ⅲ及pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达（分别减少pRNAT—TERT-ⅢTERTmRNA：67％、pRNAT—TR-ⅢTRmRNA：41％、pRNAT—TERT—Ⅲ、pRNAT—TR—ⅢTRmRNA：57％、pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR—Ⅲ TERTmRNA：70％，P〈0．05）。且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制，以联合RNA干扰尤为明显（pRNAT—TERT-Ⅲ：1．80±0．014，pRNAT—TR—Ⅲ：1．95±0．016，pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ：1．25±0．012，P〈0．05）。结论联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长，为其临床应用奠定了基础。

摘要：目的 研究非对称小干扰RNA（asymmetric structure of interfering RNA,aiRNA）沉默泛素特异肽酶22（ubiquitin specficpeptidase 22,USP22）基因对膀胱癌EJ细胞增殖的影响及其相关机制.方法 2010年8月至2012年3月,我们设计并合成USP22 aiRNA及阴性对照aiRNA（NC-aiRNA） USP22 aiRNA序列结构包括长度分别为15 bp和21 bp的正义链和反义链,将此aiRNA命名为USP22 aiRNA（15/21）,利用脂质体转染膀胱癌EJ细胞.实验分3组：对照组、NC-aiRNA组和USP22 aiRNA（15/21）组转染后48 h,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1基因mRNA和蛋白表达水平,噻唑蓝（MTT）法检测EJ细胞的增殖活性,荧光素酶报告基因检测系统检测Myc启动子活性 利用染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation,ChIP）分析沉默USP22基因后转录因子Sp1与Myc基因启动子的结合情况结果 与对照组相比,转染USP22 aiRNA（15/21） 48 h后EJ细胞中的USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1的mRNA和蛋白表达水平分别下调了（87.4±5.2）％和（91.2±7.3）％、（69.2±4.3）％和（61.0±6.6）％、（78.5±4.1）和（67.4± 5.5）％、（81.0±5.5）％和（78.3±4.0）％（P＜0.05）.MTT结果显示,USP22aiRNA（15/21）组EJ细胞的增殖活性明显受到抑制,在24、48、72和96h4个时间点的细胞生长活性分别为（85.4±5.7）％、（71.3±8.4）％、（52.5±6.7）％和（45.8±6.4）％（P＜0.05）.荧光素酶报告基因检测结果显示,USP22 aiRNA（15/21）组Myc启动子的转录活性下调（65.5±4.2）％（P＜0.05）.ChIP结果进一步显示,沉默USP22抑制了转录因子Sp1与Myc启动子的结合,USP22 aiRNA（15/21）组Sp1与Myc启动子的结合能力相比对照组下调了（48.0±3.2）％（P＜0.05）.结论 USP22 aiRNA（15/21）可能通过抑制Myc基因启动子与转录因子Sp1的结合,下调Myc的表达,从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖.

摘要：目的 观察非对称小干扰RNA（aiRNA）对膀胱癌EJ细胞泛素特异肽酶22（USP22）基因的沉默效率及特异性的影响.方法 设计并合成USP22基因的小干扰RNA（siRNA）及aiRNA,利用脂质体Translipid转染EJ细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测转染前后EJ细胞USP22 mRNA的表达水平变化,比较USP22 siRNA与USP22 aiRNA对USP22基因沉默效率及特异性的差异.结果 浓度为50 nmol/L的15/21 USP22 aiRNA能明显抑制EJ细胞中USP22基因mRNA的表达,转染48 h后USP22 mRNA的表达水平下降到最低[（8.30±1.68）%,P＜0.05],且其沉默效率和特异性明显优于USP22 siRNA.结论 以非对称小RNA干扰技术为基础设计的USP22aiRNA能够有效沉默USP22基因,并且降低了非特异性的脱靶效应,减少了受RNA干扰中的＂饱和机制＂及＂竞争机制＂的影响,弥补了传统siRNA的一些不足.

摘要：目的　探讨核酶 (RZ)在细胞水平调节雄激素受体 (AR)基因表达的作用。方法　设计并合成针对AR的锤头状核酶序列 ,分子克隆技术构建活性核酶和无活性核酶表达载体 ,脂质体介导下转染雄激素受体表达阳性细胞株T47D。转染第 1～ 3天 ,应用免疫组织化学和逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测细胞内AR基因表达水平。结果　AR活性核酶表达载体转染后 ,T47D细胞ARmRNA水平降低 2 2 .4%～ 50 .7% (P 0 .0 5)。结论　成功构建AR锤头状核酶表达载体 ,能特异性切割ARmRNA 。

摘要：目的检测人前列腺癌细胞(PC-3M)中Omi／HtrA2的表达情况,并构建其小干扰 RNA(siRNA)表达载体,探讨Omi／HtrA2对PC-3M凋亡的影响。方法以细胞免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Omi／HtrA2在前列腺癌细胞系(PC-3M)和正常前列腺细胞中的表达。利用软件辅助设计Omi／HtrA2特异性siRNA序列,体外合成后将其克隆入真核表达载体 psiRNA-hHlneo。以脂质体法转染psiRNA-Omi／HtrA2载体至PC-3M中,以RT-PCR和Western blot法检测psiRNA-Omi／HtrA2对Omi／HtrA2转录和表达的沉默效应。用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞法检测siRNA导致Omi／HtrA2基因沉默后,PC-3M细胞凋亡的变化。结果细胞免疫组织化学和RT-PCR均显示Omi／HtrA2在PC-3M细胞中高表达。酶切和DNA测序证实合成的siR- NA基因序列正确,并已被准确克隆入psiRNA-hHlneo载体中。psiRNA-Omi／HtrA2载体可特异性抑制PC-3M细胞中Omi／HtrA2的表达。转染psiRNA-Omi／HtrA2载体的PC-3M细胞凋亡下调。结论促凋亡因子Omi／HtrA2可导致前列腺癌细胞凋亡,Omi／HtrA2的表达对前列腺癌的发展有重要作用。

摘要：目的　研究锤头状核酶对雄激素受体 (AR)mRNA片段的体外切割活性 ,探讨抗雄激素基因治疗的新途径。方法　计算机模拟ARmRNA片段二级结构 ,选择第 10 18位GUC为核酶切割位点 ,设计特异性切割AR的锤头状核酶 (RZ) ,合成含T7启动子的核酶和底物模板链 ,体外转录RNA ,37℃条件下行核酶体外切割反应。结果　核酶在体外 37℃反应 1h ,可将 98%的底物RNA ( 2 5 5nt)切割为 16 8nt和 87nt2个片段。结论　特异性切割AR的锤头状核酶在体外对底物RNA有良好的切割活性 ,为应用核酶阻断雄激素受体基因表达奠定了基础。

摘要：目的　探讨反义技术阻断雄激素受体 (AR)基因表达对前列腺癌细胞生长的影响。　方法　设计、合成针对AR基因反义寡核苷酸 (ASODN) ,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞。采用RT PCR方法检测AR基因表达 ;MTT比色法检测细胞增殖活性 ;透射电镜、TUNEL检测细胞凋亡 ;流式细胞术分析细胞周期时相。　结果　 0 .5～ 2 .0 μmol LASODN作用 12～ 36h ,癌细胞ARmRNA水平降低 10 .45 %～ 82 .10 %(P <0 .0 5 ) ,细胞增殖活性抑制 11.8%～ 5 6 .9%(P <0 .0 5 ) ,细胞周期阻滞于G2 M期 ,部分细胞呈现典型凋亡形态学改变 ,凋亡比率为 34.2 5 %(P <0 .0 1)。　结论　应用ASODN封闭AR基因表达能抑制前列腺癌细胞体外生长活性 ,有望成为前列腺癌基因治疗的有效策略。

摘要：目的　探讨反义技术阻断人类端粒酶催化亚单位 (hTRT)基因表达对前列腺癌细胞生物学行为的影响。方法　设计、合成异硫氰酸荧光素标记的hTRT基因反义寡核苷酸 (ASODN) ,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞系PC3 M ,运用荧光显微镜观察ASODN在癌细胞内的分布 ,MTT比色分析、流式细胞仪、克隆形成实验检测癌细胞体外生长活性 ,RT PCR和PCR ELISA法检测hTRT基因表达及端粒酶活性。结果　 0 5～ 2 0 μmol/LASODN转染 12～ 36h后 ,ASODN逐渐聚集于细胞核 ,PC3 M细胞增殖活性抑制 34 1%～ 79 6 % (P <0 0 1) ,细胞周期阻滞于G0 /G1期 ,克隆形成能力抑制 6 1 2 6 % (P <0 0 1) ,hTRTmRNA水平降低 2 4 4 8%～ 86 73% (P <0 0 1) ,端粒酶活性抑制 2 4 74 %～ 76 72 % (P <0 0 1)。结论　运用ASODN阻断hTRT基因表达 ,降低端粒酶活性 。