摘要：本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。

摘要：目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)锤头状核酶抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。方法设计并克隆针对CⅡTA第464位点的锤头状核酶(Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性鉴定,进一步将Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464),并稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR-、DP-、DQ)类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTA mRNA水平。结果细胞外活性鉴定表明,Rz464具有明显的切割活性。细胞内切割实验显示:pRz464阳性Raji细胞表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低了75.93%、64.14%、78.32%;同时CⅡTA的mRNA含量降低(P<0.05)。结论抗CⅡTA锤头状核酶Rz464可有效抑制MHCⅡ类抗原的表达。

摘要：目的 :扩增人fgl2凝血酶原酶纤维蛋白原相关结构域 (FRED)cDNA ,构建原核表达质粒。方法 :从外周血单核细胞 (PBMNC)中提取细胞总RNA后 ,应用RT PCR方法扩增fgl2凝血酶原酶FRED段cDNA ,酶切后与pET2 2b(+)原核表达载体连接 ,然后经酶切和测序鉴定。结果 :从PBMNC中扩增了 72 7bp长的PCR产物 ,构建的重组原核表达质粒经酶切和测序鉴定与设计的相符。结论 :成功地从PBMNC中扩增了人fgl2凝血酶原酶FRED段cDNA ,构建了FRED pET2 2b(+)原核表达质粒 ,为进一步的研究奠定了基础。

摘要：目的:探讨逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测fg12凝血酶原酶在正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中的表达及其规律。方法:根据genbank中fg12凝血酶原酶基因序列设计一对引物,以β-actin的表达为内参照,采用RT-PCR方法半定量检测体外培养体系中不同时点的PBMNC中fg12凝血酶原酶mRNA的表达及变化规律。结果:fg12凝血酶原酶mRNA的表达水平在新鲜分离的PBMNC中表达最高,随着培养时间的延长而逐渐降低,至72h几乎不能检测出。结论:RT-PCR方法半定量检测PBMNC中fg12凝血酶原酶mRNA灵敏度高;PBMNC中的fg12凝血酶原酶在体外培养体系中不能持续表达。

摘要：目的:构建针对CHK(checkpoint kinase,细胞周期检测点激酶)1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA),观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系-HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响。方法:设计并合成了针对CHK1的shRNA,将其导入本室构建的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的RNAi(RNA interference,RNA干扰)表达载体中。通过RT-PCR和Western blotting分别检测HeLa细胞CHK1基因和蛋白水平的表达,以流式细胞仪测细胞凋亡,MTT法检测细胞的增殖。结果:成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1。与对照组和空载体转染组相比,shRNA使细胞中CHK1mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%。此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显高于对照组,其增殖活性则明显低于对照组。结论:本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况,且不影响H1启动子的体内转录。CHK1shRNA能诱导HeLa细胞凋亡,抑制该细胞的增殖,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供了实验基础。

摘要：目的:克隆人fgl2凝血酶原酶cDNA,分析其序列组成,构建真核表达载体。方法:从外周血单个核细胞中提取总RNA后,应用RT-PCR方法扩增fgl2凝血酶原酶cDNA,目的基因与pcDNA3真核表达载体连接,经酶切和测序鉴定,应用软件分析其序列。结果:克隆了人fgl2凝血酶原酶cDNA全长序列,所扩增的cD-NA序列与genebank中发布的序列一致,构建的pcDNA3-fgl2真核表达载体与所设计的完全一致。结论:成功地克隆了人fgl2凝血酶原酶cDNA,构建了其真核表达载体,为研究其生物学功能奠定了基础。