摘要：本试验旨在利用新型荧光探针-分子信标建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的分子信标实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。根据ASFVB646L基因序列的保守区域设计特异性引物和分子信标探针,通过反应体系和反应条件的优化,建立标准曲线,测定本方法的敏感性、特异性和重复性;并通过检测207份临床样本,比较本方法与国家标准qPCR方法和商品化ASF检测试剂盒之间的符合率以及得出kappa系数。结果显示,该方法标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.9974,最低检出浓度为1 copies/μL,且与5种常见猪源病原体之间无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.81%;临床样品检测结果显示,本方法与国家标准qPCR方法和商品化ASF检测试剂盒的总体符合率分别为97.10%和98.55%,kappa系数分别为0.9104和0.9556。结果表明,本试验建立的ASFV检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好、检测结果可靠,为ASF的检测和该病的防控提供了技术支持。

摘要：【目的】获得可稳定表达猪O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)抗原表位融合结构蛋白VP1的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1),制备亚单位疫苗。【方法】设计合成含FMDV抗原表位与VP1基因序列的重组基因RP1,将其克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中,将构建的重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染HEK-293T细胞,获得重组慢病毒HIV-RP1;将收获的病毒液感染CHO-K1细胞,经筛选获得单克隆细胞株,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定,获得可表达RP1的阳性细胞株,命名为CHO-K1-RP1;将CHO-K1-RP1连续传30代,每隔5代收获相同数量的细胞样品进行Western blot鉴定。【结果】IFA结果显示,表达RP1的细胞发出绿色荧光,而空白对照无绿色荧光;Western blot结果显示,在约55 kU处能观察到清晰的条带;表明成功获得了融合蛋白。将获得的融合蛋白与佐剂等体积混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠,抗体检测结果显示,二次免疫后,该亚单位疫苗组与口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)商品化灭活疫苗组小鼠之间抗体水平无显著差异,两者抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)。【结论】本研究构建的亚单位疫苗能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应,为猪口蹄疫新型疫苗的研制提供了参考。

摘要：本研究利用沙门氏杆菌属特异的invA基因序列,设计一对特异性的引物,通过PCR反应来检测多种样品中的沙门氏杆菌;反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果显示:此PCR方法检测沙门氏菌属的特异性为100%;样品中活菌的检测限为1.43CFU/10g;反应的最佳退火温度是65℃;最适模板浓度范围在104～108copies/ml。本方法与传统的沙门氏杆菌检测方法以及最近报道的相关方法比较,具有简单、快速、特异性好和敏感性高、经济等特点,并可满足大批样品沙门氏杆菌筛选检测的要求。

摘要：根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA 3的序列,设计1对特异性引物,以重组质粒pcDNA 3/IL-18为模板,扩增出具有完整真核表达结构的CM V-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA 3/om pH中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成功构建了共表达禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因和鸡IL-18基因的重组表达质粒。将共表达质粒转染Cos7细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及W estern b lotting检测,证明了外膜蛋白H基因及鸡IL-18基因均获得了瞬时表达,为研究禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H的免疫原性和鸡IL-18在基因疫苗中的免疫调节作用奠定了基础。

摘要：根据国内外已公布的AIV H5N1亚型全基因组序列设计了8对引物,对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A/Duck/Guangdong/DG01/05(简称DG01)毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22 341bp,PB1 2 341bp,PA2 233bp,HA1 779bp,NP 1 565bp,NA1 398 bp,M1 027bp,NS 875 bp 8个节段组成,与往年及同年一些流行株比较分析结果显示,DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征,NA基因及NS1基因均有部分缺失,从基因特点分析属于2005年流行代表株。

摘要：目的建立牛源贾第虫套式PCR检测方法。方法根据牛源贾第虫TPI基因序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立套式PCR检测方法;通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验;并用临床样品进行验证。结果该套式PCR能特异性地扩增出牛源贾第虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、环孢子虫、弓形虫、毛首线虫和纤毛虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到0.395fg的阳性参照DNA。结论建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,可以用于临床样品的检测。

摘要：目的克隆表达锡兰钩虫血小板抑制剂(hookworm platelet inhibitor, HPI)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法 以锡兰钩虫cDNA 为模板,参考已公布的犬钩虫血小板抑制剂(AcaHPI)基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR 扩增其AceHPI基因序列,并将其连接至pET-28a表达载体,诱导其表达并纯化。利用在线软件对其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比对和生物信息学分析。结果 锡兰钩虫AceHPI基因的ORF序列全长603 bp,编码200个氨基酸,与犬钩虫AcaHPI氨基酸序列同源性为91%。构建的重组表达质粒pET28a-AceHPI经诱导表达与纯化,获得了分子质量约为26 kDa的可溶性融合蛋白。预测分析表明该蛋白为疏水蛋白,前17个氨基酸为信号肽序列且无跨膜结构域。结论 成功克隆表达了AceHPI基因并对其编码氨基酸进行了生物信息学分析,为进一步研究AceHPI在感染宿主体内的作用机制奠定了基础。

摘要：目的寻求快速检测食品中沙门氏菌的技术方法支持。方法根据沙门氏菌编码侵袭蛋白E(invasion protean E,invE)的基因设计一对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行PCR扩增,建立了沙门氏菌特异、敏感和快速的PCR检测方法,并对食品中的沙门氏菌进行了检测。结果该方法能检测出3.0×102cfu/mL纯培养的沙门氏菌,4种人工染菌食品的模拟检测结果显示,当各食品中初始含菌量分别为1.5cfu/g(火腿肠)、2.4cfu/g(鲜猪肉)、1cfu/ml(包装鲜奶)和1cfu/g(鲜鸡蛋)时,分别经过6h、18h、12h和18h增菌,PCR检测为阳性,而阴性对照组均为阴性。结论方法具有耗时少,特异性强,敏感性高,操作简便,费用低的优点。

摘要：本研究旨在建立猫急性应激模型,筛选诊断标志物,完善猫急性应激定义标准。选取18只猫随机分为对照组、应激组A和应激组B,每组6只。测量各组猫的生理指标,评估猫应激评分(CSS),采血进行血常规和血生化分析;ELISA法检测血清炎性因子、激素、五羟色胺(5-HT)和热休克蛋白-70(HSP-70)浓度;微量法检测血清氧化应激指标。结果表明,与对照组相比,应激组A的体温、呼吸频率、CSS、尿素氮(BUN)含量、肌酸激酶(CK)活性、IL-1β、TNF-α、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(COR)、肾上腺素(EPI)、5-HT浓度显著升高(P0.05);应激组B的体温、呼吸频率、CSS、WBC、NEUT、RBC数目、GLU、BUN、TG含量、CK、AST、SOD、CAT活性、HGB、IL-1β、TNF-α、CRH、ACTH、EPI、HSP-70、5-HT浓度显著升高(P0.05)。结果提示,本研究设计的复合应激和束缚应激均能成功建立猫急性应激模型,并筛选出CRH、ACTH和CSS可用于完善猫急性应激的定义标准。

摘要：为研究刚地弓形虫α-微管蛋白(TgTUBA1)与神经瘤母细胞(N2a)自噬的关系,利用TgTUBA1基因的CDS序列设计引物并引入HA标签序列,提取弓形虫ME49虫株总RNA并反转录获得cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的片段,并克隆至pcDNA3.1(+)载体上。将构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1转染至N2a细胞内,通过透射电子显微镜和荧光显微镜观察自噬小体,并通过Western-blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ的表达变化。结果显示,成功构建了pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1真核表达载体,Western-blot试验检测到50 ku大小的特异目的条带。与空载体组相比,pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1转染N2a细胞48 h后,N2a细胞皱缩、突触减少;观察到特征性的自噬小体;自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表达上调。本研究证明了TgTUBA1蛋白可以促进N2a细胞自噬现象的发生,这为宿主细胞抗弓形虫感染提供了新的研究思路。