摘要：为缩短J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)检测周期,进一步加快禽白血病净化进程,本研究结合SYBR GreenⅠqPCR和混样检测,建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术(ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction, ALV-J-B-qPCR)。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列,设计ALV-J的特异性引物,并优化反应条件,建立了ALV-J SYBR GreenⅠqPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料,分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测,筛选最佳检测模板;进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法,血液混样总体积为200μL的混样方法,血液混样总体积为10μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性,筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法,成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验,并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示,该方法仅特异性扩增ALV-J,对标准质粒的最低检测限度为1×10^(2)copies·μL^(-1),批内与批间变异系数均<1%。对90份临床送检血液样品的检测结果显示,该qPCR方法对ALV-J的检出率(15.6%)高于p27抗原ELISA和普通PCR的检出率(12.2%)。检测模板筛选试验中,抗凝血DNA最符合检测准确度高、操作复杂度和成本低的要求,为最佳检测模板。混样方法摸索试验中,混样总体积为10μL(混样规模<12份)的混样方法检测准确性最高,为最佳混样方法。在样本数为400份,预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%,比病毒分离法高2.00%;在样本数为400份,预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%,比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势,为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

摘要：为建立一种快捷、可行的检测H3亚型猪流感病毒(SIV)的方法,本研究根据GenBank中登录的H3亚型SIV HA基因的保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了一种检测H3亚型SIV的SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法,并进行灵敏度、稳定性和特异性试验,与普通PCR进行比较。研究结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,R2为0.994,CV在0.17%～1.41%之间,具有良好稳定性。除H3亚型SIV外,对H1、H4、H6、H9亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒和猪圆环病毒2型的检测均为阴性,与普通PCR相比更灵敏。该方法特异性好,准确率高,适于临床分离鉴别H3亚型SIV。

摘要：为了研究Ⅱ型禽腺病毒pⅢa基因的抗原性,试验根据Ⅱ型禽腺病毒火鸡出血性肠炎病毒(HEV)VAS株的全基因序列(GenBank序列号为AY849321.1)设计了1对引物,采用PCR扩增出pⅢa的完整基因,将其连接到质粒表达载体pET-32a(+),获得的阳性克隆命名为pET-32a-pⅢa,再将pET-32a-pⅢa转化至*** BL21(DE3),经37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导表达5 h,应用SDS-PAGE分析超声裂解后的上清液和沉淀。结果表明:目的蛋白以可溶性蛋白形式存在,蛋白分子质量约为76 ku,目的蛋白具有较好的抗原活性。

摘要：根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

摘要：试验利用PCR方法检测101株不同源鼠伤寒沙门氏菌携带质粒的不相容群,共设计18对引物,PCR分为5个三重PCR和3个单一PCR,用来检测识别FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FII复制子。101株不同源鼠伤寒沙门氏菌中94株(93.1%)携带质粒不相容群,共携带10种质粒不相容群,分别是Inc HI1、Inc HI2、Inc I1、Inc FIA、Inc FIB、Inc N、Inc Y、Inc P、Inc FIIA和Inc FrepB,其中76.6%的菌株携带2个或2个以上质粒不相容群。结合药物敏感性试验结果,追踪鼠伤寒沙门氏菌耐药传播机制。本研究调查了耐药性质粒在鼠伤寒沙门氏菌的水平传播特性,不同环境中大量的菌株介导特定多重耐药性质粒的扩散,对调查跟踪质粒赋予耐药的流行病学有重要意义。

摘要：试验针对J亚群禽白血病病毒的env及LTR基因,根据它们的保守序列,分别设计合成了4～5对siRNA,并将其克隆至pSilencer 4.1,构建siRNA重组表达质粒。将该质粒转染DF-1细胞6 h后以103TCID50接种ALV-J,利用Real-time RT-PCR在mRNA表达水平检测各重组质粒对病毒复制的影响。结果表明,与阴性对照相比,pSi4.1-env各重组质粒对env基因的抑制效果达到18.15%～63.43%,pSi4.1-LTR各重组质粒的抑制效果则达到19.37%～45.41%。

摘要：为建立可同时检测临床上主要流行的JK亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroupJ/K,ALV-J/K),选取ALV-J(CHN06)pol基因3′端和gp85编码基因之间的保守区域及ALV-K(GDFX0601)gp85编码基因保守区域设计引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了可同时检测ALV-J和ALV-K的双重荧光定量PCR方法,并通过特异性实验、灵敏性实验和稳定性实验对该方法进行评估。结果显示,该方法仅能特异性扩增ALV-J和ALV-K,与A、B、E亚群ALV及其他常见禽类病毒等均无交叉反应;其最低检测限度为3.16×10^(1)copies/μL,比普通PCR灵敏性高100倍;其批内与批间变异系数均小于2%;将101份血浆样品接种DF-1细胞,并分别通过ALV-J/K双重荧光定量PCR、ALV p27 ELISA和普通PCR检测,结果显示,3种检测方法的总阳性率分别为17.8%(18/101)10.9%(11/101)和10.9%(11/101)。以上结果表明,该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,可为ALV-J和ALV-K的诊断提供技术支持。

摘要：为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10^2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10^4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。

摘要：试验针对J亚群禽白血病病毒的env及LTR基因，根据它们的保守序列，分别设计合成了4～5对SiRNA，并将其克隆至pSilencer4．1，构建siRNA重组表达质粒。将该质粒转染DF-1细胞6h后以103TCID50接种ALV—J，利用Real—timeRT—PCR在mRNA表达水平检测各重组质粒对病毒复制的影响。