摘要：靶向降解技术是一类利用真核细胞内天然存在的降解机制对胞内有害物质进行特异降解、以维持和改善细胞稳态的重要技术。该技术主要通过泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway),特异性清除细胞内错误折叠或聚集的蛋白质、大分子复合物、受损或老化的细胞器及一些非蛋白类物质。其中基于细胞自噬的靶向降解技术具有专一性强、底物种类广泛等诸多特征,使其成为一备受期待的技术,有望应用于神经退行性疾病、代谢性疾病等多种疾病的治疗。目前这一技术的应用潜能还远未被完全开发,特别是在植物研究领域。本综述首先详细介绍了各类基于自噬-溶酶体途径的靶向降解技术的作用机制、特点以及优势;并且结合华南农业大学李发强教授课题组的研究工作,着重介绍了设计和改造植物选择性自噬衔接蛋白方面的研究和设想,以期达到将对植物生长发育不利的因子经由细胞自噬转运并区室化隔离于液泡的目的,进而开发能够抵御病毒侵染或抵抗有害物质的农作物新品种;最后展望了靶向自噬的降解技术在植物科学研究和农业生产中的潜在应用前景和所面临的挑战。

摘要：西藏拟南芥是近年于青藏高原地区发现的一个新的拟南芥生态型,现已成为研究植物高原适应性的模式材料。图位克隆是分离目标基因的常用手段之一,然而有效分子标记的缺少严重阻碍了西藏拟南芥对高海拔适应机制的研究。本研究对西藏拟南芥基因组进行组装,获得了相对完整的西藏拟南芥基因组,并通过BLAST序列比对筛选和重新设计了一套均匀分布于5条染色体的InDel分子标记引物。结果表明,实验验证的119对InDel分子标记引物中,54对引物在西藏型和哥伦比亚型之间具有多态性;其中37对引物扩增效果最好,在2%琼脂糖凝胶中即可产生清晰的多态性条带,并用于后续研究。初定位连锁图表明,西藏拟南芥株高矮化基因定位于4号染色体9.3~16.2 Mb区间。本研究开发的分子标记能够有效对西藏拟南芥进行基因分型,为西藏拟南芥的正向遗传研究奠定了基础。

摘要：[目的]为探讨裂褶菌多糖的两种固体发酵方法及其大孔树脂纯化。[方法]设计了以玉米、大米为基料的两种固体发酵培养基培养裂褶菌,通过热水提取法(料液比1∶30,80℃,12 h)提取裂褶菌多糖,并采用动态吸附实验筛选盐类、核酸、蛋白质、色素吸附率最高的大孔树脂。[结果]28℃培养35 d,裂褶菌在米饭固体培养基(RSM)生长深度近20%,在玉米固体培养基(CSM)的生长深度达到100%;玉米发酵物、米饭发酵物的裂褶菌多糖提取率分别为4.8%、5.9%(以发酵物湿重计);在上样流速3 BV/h(1 BV=2 L)、上样体积10 L条件下,6种型号的大孔树脂中,树脂SA-210纯化效果最佳,盐类、核酸、蛋白质等杂质的吸附率分别为84.18%、98.02%、96.81%。[结论]裂褶菌在CSM生长深度是在RSM上的5倍,玉米固体培养基比米饭固体培养基更适合裂褶菌的生长;树脂SA-210对盐类、核酸、蛋白质等杂质具有较强吸附能力,吸附率均高于80%,且吸附效果稳定,适用于裂褶菌多糖的纯化。

摘要：根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。

摘要：本研究利用广泛用于肠道感染机制研究的IPEC-J2细胞系探究poCRIP2在猪胃肠道炎症中的作用。在识别poCRIP2基因全长序列的基础上研究poCRIP2的有关特征,同时对其组织表达模式进行分析,并建立有效的poCRIP2三维结构模型以解释其功能,了解poCRIP2在细菌感染过程中的免疫作用及其与NF-κB通路的关系。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪心获得poCRIP2的全长序列;利用Primer Premier5.0和NCBI Primer BLAST程序设计了特异性引物对,采用保家基因β-肌动蛋白(β-actin)对结果进行归一化处理,测试CRIP2基因在猪体内的组织分布;采用生物信息学方法对poCRIP2的特性进行分析,构建poCRIP2蛋白模型;利用ROBETTA服务器,以高度同源的小鼠LIM-homeodomain protein islet 1(Isl1)(PDB:4 JCJ)为模板,模拟poCRIP2的三维结构;用PROCHECK和ProSA对模型进行了分析;应用Procheck对蛋白质折叠进行立体化学和拓扑分析,并应用ProSA对蛋白质折叠进行评价;使用PyMOL程序对建模结果进行评估,分析poCRIP2的保守结构域;设计肠道感染试验,分析poCRIP2在肠道免疫中的功能。结果表明,从猪心获得的poCRIP2 cDNA全长序列为1118 bp,poCRIP2蛋白与人和小鼠的同源性分别为94.23%和93.75%,它还含有两个保守区(LIM-TLP和LIM-CRP)。poCRIP2的组织表达模式分析表明,poCRIP2在所有组织中均有表达,其中在小肠、肺、胃、脾和肌肉等中表达较低。poCRIP2在革兰阴性菌作用下的表达水平比对照组高1~2倍,但NF-κB通路在同一作用下被激活,无抑制作用,poCRIP2可能不与NF-κB通路相互作用,而与其它通路共同作用于肠道免疫。本研究成功获得了猪CRIP2基因的全长序列,poCRIP2的组织表达模式表明,poCRIP2与人CRIP2相似,建立了可靠的三维结构模型,基于该模型推测poCRIP2中包含的功能主要由β折叠和α-螺旋结构实现,革兰阴性菌感染肠道后poCRIP2能被显著上调,poCRIP2应不依赖于NF-κB通路,在肠道免疫中起其他作用。

摘要：本试验旨在实现猪β防御素1(poricine-β-defensin 1,PBD-1)在毕赤酵母中的表达,获得有抗菌活性的抗菌肽PBD-1。根据PBD-1的氨基酸序列和酵母密码子偏好性,设计优化其核苷酸序列,利用SOE-PCR技术获得PBD-1基因序列,克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-PBD-1,经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母SMD1168中。PCR筛选得到阳性酵母表达菌株,经甲醇诱导后得到分子质量约4.5ku的抗菌肽PBD-1。抗菌特性研究结果表明,表达产物抗菌肽PBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果。

摘要：[目的]由于AiiA(Autoinducer inactivation,AiiA)蛋白能有效降解AHLs(N-acyl-homoserine,AHLs),导致病原菌由于群体淬灭(Quornm quenching,QQ)失去生存优势而抑制其致病能力;利用强启动子构建能高效表达AiiA蛋白的枯草芽孢杆菌,检验枯草芽孢杆菌中Pspac启动子表达AiiA蛋白的能力,寻求有效生物防治手段防治病原菌侵害。[方法]通过已知的aiiA基因序列和启动子Pspac序列设计引物,经搭桥PCR搭连启动子Pspac和aiiA基因,构建重组表达载体Pspac-aiiA-PHY300PLK,经酶活反应确定重组菌活性。[结果]成功克隆并搭连Pspac启动子和aiiA基因,AiiA蛋白成功在重组枯草芽孢杆菌C11中表达。经酶活检验,野生菌株和重组菌株Pspac-aiiA-C11有降解信号分子AHLs的能力,但重组菌降解能力更强。[结论]重组菌Pspac-aiiA-C11较野生菌株有更强的降解AHLs效力;要利用工程菌进行生物防治还需进一步提高工程菌表达AiiA蛋白的能力及稳定性。

摘要：为构建猪源抗菌肽PR39的高效表达真核载体pVAX1-PR39,通过猪股骨骨髓组织基因组RNA合成c DNA,根据PR39基因全长序列,设计高效表达启动子,利用PCR扩增获得PR39全长基因,连接到真核载体pVAX1,构建重组载体pVAX1-PR39。转化大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR鉴定和测序,测序结果与NCBI网站上猪源抗菌肽PR39基因序列完全一致,表明已成功构建了猪PR39的真核表达载体,理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。

摘要：目的:试验不同的保护剂成分配方,探究分离自婴儿粪便的2种益生菌(嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌)在常温条件下保持较高活性的可行方法。方法:利用均匀设计实验方法设计保护剂配方,用于保存特定高活性高稳定性的菌种,在不同时间点检测活菌数,分析数据得出最佳保护剂成分比例。结果:嗜酸乳杆菌10A31保护剂最佳配方为:海藻糖∶谷氨酸∶天冬氨酸=5∶24∶24;长双歧杆菌11A11保护剂最佳配方为:海藻糖∶谷氨酸∶麦芽糖=34∶11∶10;用最佳保护剂配方保存后,嗜酸乳杆菌10A31在200 d时的菌落计数结果为3.87×109CFU/g,长双歧杆菌11A11在160 d时为1.53×109CFU/g,均具有较高的活性。结论:最佳保护剂配方使2个菌种常温保存期至160 d。