摘要：目的 建立克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）的可视化逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP）快速检测法.方法 体外合成CCHFV的S基因,构建重组质粒,体外转录为模板RNA,在线设计3组LAMP引物,使用实时浊度仪筛选出最佳引物,以羟基萘酚蓝（Hydroxynaphthol blue,HNB）作为指示剂,建立可视化RT-LAMP反应体系.结果 实时浊度检测结果显示合成的3组LAMP引物中第1组引物的扩增效率最高,峰值出现于20 min.添加环引物后,扩增效率进一步提高,13 min即可达到峰值.利用最佳引物建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法最低检测限浓度为10拷贝/μl,检出时间为30 min,较巢式RT-PCR法和实时定量RT-PCR法分别高1-3个数量级.该方法稳定性好,不会与症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒（汉滩型和汉城型）、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒（GP蛋白和VP蛋白）产生交叉反应.结论 建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法,灵敏度好、特异度高、快速廉价、操作简单,无需开盖即可直接观察结果,适用于条件有限的基层单位和偏远地区.但仍需临床样本进行进一步验证.

摘要：目的建立针对贝氏柯克斯体的快速可视化环介导等温扩增(LAMP)方法。方法体外合成贝氏柯克斯体的IS1111a基因,构建重组质粒。利用在线引物设计软件设计3组LAMP引物,用实时浊度仪筛选出最佳引物,同时对羟基萘酚蓝浓度进行优化,建立可视化LAMP反应体系,并评价其敏感性和特异性。结果建立的可视化LAMP反应可准确检测出贝氏柯克斯体的重组质粒和新桥株,不与其他立克次体产生交叉反应,最低可检测到3.6×10~2拷贝/反应,较普通聚合酶链反应(PCR)法的灵敏度提高了一个数量级,等同于实时浊度法和实时荧光定量PCR方法的检测灵敏度。结论建立的可视化LAMP方法可敏感、特异地检测出贝氏柯克斯体感染,操作简单快捷,适用于基层卫生防疫和疫情现场的病原筛查。

摘要：目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x+40.988(HTN),y=-3.5307x+39.356(SEO),扩增效率分别为92.2%(HTN)和92.6%(SEO),相关系数R2分别为0.9968(HTN)和0.9997(SEO),呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。

摘要：目的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是近年来发展起来的一种新型核酸扩增技术,文中旨在建立一种LAMP方法用于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的快速检测。方法利用在线引物设计软件,针对B型和C型HBV基因序列的相对保守区域,设计LAMP引物、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)引物和探针序列。采用羟基萘酚蓝作为显色剂,优化反应条件,分别建立HBV的可视化LAMP反应体系和q PCR反应体系。反应体系中酶量为1.5μL、反应温度为65℃为LAMP扩增的最佳条件。用2种方法同时检测临床样本(96例乙型肝炎患者、5例丙型肝炎患者、5例获得性免疫缺陷综合症患者及50例健康对照样本的血清核酸),以q PCR检测结果为金标准,评价可视化LAMP方法诊断HBV的敏感性和特异性。结果建立的LAMP方法和q PCR方法最低可检测到10 copies/μL。96例乙型肝炎患者中,q PCR法共55例扩增阳性,其中LAMP方法共42例阳性,敏感性为76.4%(42/55);对病毒滴度高于102copies/μL和低于102copies/μL样本的检测敏感性分别为96.8%(30/31)和50%(12/24)。LAMP方法可成功检出B型和C型HBV,且不会和其他经血传播的病毒发生交叉反应,特异性为100%。结论建立的LAMP方法操作简便快捷、结果判读方便,能在1 h内敏感、特异地检测出血清中的HBV,为基层单位筛查HBV提供新的方法。

摘要：目的构建并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV-Z10）S基因蛋白编码区前300bp核苷酸序列，研究该基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达及其产物的生物活性。方法根据HV-Z10 S基因前300bp（S300）的核苷酸序列，按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式，设计合成8条引物，通过连续PCR，获得人工合成Z10株S基因前300bp的基因序列SP300，经测序，SP300与S300的核苷酸相似性为76.2％，但编码的氨基酸序列完全一致。将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA，构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300。将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株，筛选重组转化子。结果重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导，表达出重组蛋白rNP300及rN300，SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10^3左右。经ELISA检测及Western Blot分析，表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应。结论SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达，使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致，表达量在诱导24h后最高。

摘要：为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本研究根据已发表的鸡源补体C3d序列,设计并合成在5'端添加编码连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有3拷贝C3d与VP2基因融合的重组表达质粒pcDNA-VP2-3C3d。用脂质体法转染BHK21细胞,48 h后,westernblot分析表明,表达的重组蛋白为162 ku;间接免疫荧光试验检测转染细胞中具有特异性荧光。用pcDNA-VP2-3C3d与前期构建的pcDNA-VP2分别免疫2周龄SPF鸡,二免14 d后,间接ELISA法检测IBDV抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d组抗体水平显著高于pcDNA-VP2组;MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,pcDNA-VP2-3C3d组免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性显著高于pcDNA-VP2组(p<0.05)。本研究表明C3d可以增强VP2基因免疫诱导的IBDV特异性体液和细胞免疫应答。

摘要：目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。