摘要：目的已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a/C3aR轴过度活化现象,但有关C3a/C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3a的肾小肾小管上皮细胞株,为探讨各种病理情况下C3a/C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a分泌性表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2,根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析,从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果 1成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功进行了重组慢病毒包装,得到了高滴度(5×108个/m L)的C3a表达重组慢病毒LV-C3a;3成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染,得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株;基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实,与HK2细胞比较,HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P<0.01],分泌的C3a水平显著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P<0.01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a/C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3a/C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。

摘要：目的前期的研究中发现过敏性毒素C3a受体(C3aR)在糖尿病肾病病中表达增加,但在糖尿病肾中的病理意义及其在肾组织足细胞中的生理作用尚不清楚,文中通过建立C3aR低表达的肾足细胞系(HPC-C3aRsiRNA),为研究C3aR在肾足细胞中的生理功能提供细胞模型。方法设计合成人C3aR小干扰RNA(C3aRsiRNA),将其克隆到慢病毒表达载体中,通过与包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aRsiRNA慢病毒,利用C3aRsiRNA慢病毒感染人肾足细胞HPC,根据C3aRsiRNA慢病毒具有嘌呤霉素抗性基因的特点筛选稳定转染的人肾足细胞。通过荧光定量PCR分析稳定转染的足细胞C3aR的mRNA表达水平,Western blot和免疫组化染色分析稳定转染的肾足细胞C3aR蛋白水平,鉴定稳定转染C3aR低表达的肾足细胞系。结果荧光定量PCR结果显示,与HPC-C3aRsiRNA细胞C3aR的mRNA水平(0.26±0.04)比较,非转染HPC细胞(1.00±0.13)和阴性对照(1.07±0.16)显著升高(P<0.05)。免疫组化染色显示HPC-C3aRsiRNA细胞的C3aR蛋白水平显著降低。Western blot结果显示,与HPC-C3aRsiRNA C3aR蛋白表达(0.62±0.09)比较,正常HPC、阴性转染的HPC表达(1.00±0.08、1.00±0.22)显著升高(P<0.05)。结论成功构建了C3aR低表达的肾足细胞系,可为进一步了解C3aR在肾中的生理作用提供细胞模型。

摘要：目的:建立基于实时定量PCR的线粒体DNA(mt DNA)拷贝数的检测方法,并利用所建立的方法初步检测和探讨mt DNA在肾脏疾病诊断中的应用。方法:设计mt DNA PCR扩增引物,PCR扩增获得mt DNA片段,与T载体质粒连接,构建mt DNA定量标准品。采用SYBR Green-Ⅰ染料法实时定量PCR方法建立mt DNA定量的标准曲线,检验定量方法的重复性与特异性。利用所建立的方法检测局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者血清mt DNA和尿液微囊泡(MV)mt DNA的变化;此外,还对体外嘌呤霉素氨基核苷(PAN)刺激的足细胞所分泌的MV中mt DNA进行了检测。结果:(1)选取mt DNA特异性引物,通过SYBRGreen-Ⅰ实时定量PCR建立mt DNA拷贝数绝对定量的检测方法具有良好的特异度、灵敏度和重复性;(2)检测10例FSGS患者和6例正常对照血清mt DNA水平发现,FSGS患者血清mt DNA水平明显低于正常对照(P<0.05);(3)检测5例FSGS患者与5例健康对照一定体积尿液中MV mt DNA含量发现,FSGS患者高于健康对照,但FSGS患者尿液MV的含量也显著高于健康对照;(4)受PAN刺激的足细胞,其分泌的MV中mt DNA含量下降,与足细胞内mt DNA含量变化相一致。结论 :本方法为探索mt DNA作为肾脏疾病诊断的生物标志物的可能性提供了有效的实验手段。

摘要：目的:利用合成的podocin多肽制备针对斑马鱼podocin的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用于斑马鱼足细胞损伤研究中。方法:(1)设计、合成斑马鱼podocin抗原多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,protein A亲和纯化得到抗podocin多克隆抗体;(2)ELISA和免疫组化检测抗体效价及组织特异性;(3)构建足细胞特异性表达硝基还原酶(NTR)的转基因斑马鱼Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-m Cherry),NTR/MTZ(甲硝唑)系统特异性地诱导足细胞损伤;用podocin反义寡核苷酸阻断正常斑马鱼胚胎podocin mRNA的翻译过程,利用抗podocin抗体对上述两种疾病模型进行免疫荧光染色以验证合成的podocin抗体能否应用于斑马鱼足细胞研究中。结果:(1)化学合成的多肽纯度为92.6%,达到免疫用抗原标准;(2)ELISA和免疫组化染色结果表明抗体效价分别达1∶5.12×105和1∶106;(3)免疫荧光染色表明无论在斑马鱼前肾还是中肾,podocin均特异性地表达于足细胞,且沿着毛细血管袢呈连续、线性分布,表明抗体具有良好的组织特异性;(4)MTZ诱导足细胞损伤24h后见podocin呈粗糙的颗粒状分布,48h后阳性表达面积占整个肾小球面积比值明显下降;(5)显微注射podocin反义寡核苷酸的斑马鱼胚胎出现心包水肿、体轴弯曲的表型,第3天时几乎无Podocin表达,随后逐渐恢复至正常,第5天时表达与正常组无异。结论:所制备的斑马鱼抗podocin抗体效价高、组织特异性强,能够反应足细胞损伤情况,是斑马鱼足细胞研究的有力工具。

摘要：目的:分析半乳糖凝集素3(Gal-3)及成纤维细胞生长因子23(FGF-23)与慢性肾脏病(CKD)患者心血管危险因素和心血管重塑的相关关系,评价与传统标记物组合预测心血管风险的价值。方法:分析CKD患者临床信息,完善常规实验室检查,检测N-末端脑钠肽前体(NT-pro BNP)、肌钙蛋白T(Tn T)、Gal-3和FGF-23浓度。心脏超声测定相对室壁厚度和左心室质量指数,将心脏塑形分为结构正常与左心室塑形改变(包括左心室重塑、向心性肥厚与离心性肥厚)。以左心室塑形改变为标准,比较NT-pro BNP与Gal-3和FGF-23不同组合的ROC曲线下面积(AUC)。结果:共纳入CKD患者270例(2期57例、3期74例、4期68例、5期71例)。Gal-3和FGF-23水平均与患者多重心血管危险因素相关,包括收缩压、血红蛋白、血清白蛋白、磷、甲状旁腺激素、NT-pro BNP、Tn T、e GFR水平及是否合并糖尿病(P0.05);NT-pro BNP与Gal-3组合或三者组合可轻度提高AUC(P>0.05)。结论:Gal-3与FGF-23水平不仅与CKD患者多重心血管危险因素相关,且反映左心室塑形改变;两者与NT-pro BNP组合可提高判断心血管风险的价值。

摘要：目的随机分配遮蔽对保证高质量的随机对照临床试验(RCT)具有重要意义。文中通过对信封法随机分配遮蔽技术的改进,以期设计一种更为便捷、有效的两联单随机分配遮蔽方法。方法根据产生的随机分配序列,为每一受试者制作一份随机分配两联单,并按顺序装订成册,制作成带有封面和使用说明的随机分配簿。两联单的第一联为说明联,第二联为分配联,两联序号相同、四周密封胶联,并在两联的相同区域处留空用于签署受试者信息。第一联书写的内容可完全复写至第二联上;第二联分配信息的背面涂黑印刷,避免透光识别而导致分配信息的提前破解。当研究者确定受试者合格后,依先后顺序选择受试者对应的两联单。在第一联签署受试者信息后沿周边撕开暴露第二联分配信息,并将该受试者分配至第二联上所指定的组别。随机分配薄可委托专业印刷机构。按照随机分配序列表,并在严格的质量控制下印刷制作,对于多中心临床试验可分中心独立印制。结果该方法已在18项临床试验中得到应用,其中5项为多中心试验,3项为产品注册试验。结论两联单随机分配簿方法制作容易、操作简单、监查方便,可有效实现临床试验随机分配遮蔽,对确保随机化质量具有较强的实用价值。

摘要：目的构建过表达C3a受体(C3aR)的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3aR表达载体和过表达C3aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。