摘要：目的 观察基因芯片分析联合小型干扰（siRNA）人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列（pRNAT-TERT-Ⅲ：GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ：CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位）.构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰（RNAi）装置pRNAT-TR-Ⅲ＋pRNAT-TERT-Ⅲ（脂质体法）并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析hTR和hTERT mRNA表达（以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析）,端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）检测端粒酶活性（测其A值）,噻唑蓝（MTT）比色法检测BIU-87细胞的生长抑制（按MTT法检测转染细胞的存活率）,并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录（RT）-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达（pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-ⅢTERT：0.300±0.033,P＜0.05;TR：0.430±0.028,P＜0.05）.且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制（pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-Ⅲ：1.250±0.012,P＜0.05）.联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调（ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1）.结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致.

摘要：目的 :建立顺序特异引物聚合酶链反应 (PCR SSP)方法检测HLA B2 7基因并与血清学方法比较。方法 :设计合成B2 7特异引物 3个和内源性阳性对照 2个 ,建立PCR SSP方法 ,用于B2 7基因分型。血清学分型为一步法单克隆抗体方法。临床样本 10 0份 ,来源于可疑强直性脊柱炎患者。快速酚氯仿法提取模板DNA。结果 :10 0例临床样本PCR SSP行B2 7基因分型均获成功。总耗时 4h。其中B2 7阴性 5 8例 ,阳性 42例 ,5例临床诊断为强直性脊柱炎 ,占 11 9%。 30份样本同时行血清学分型 ,2 0份B2 7阴性 ,5份阳性 ,5份可疑阳性。其中 2 0份阴性中 3例为阳性 ,5份可疑阳性中 2例为阴性。结论 :PCR SSP行B2 7基因分型 ,分辨度高、特异性强 ,快捷、准确 ,适合于临床应用。

摘要：目的采用细胞因子基因芯片技术,检测肾移植受者5种细胞因子及其受体的21个等位基因位点的基因多态性,并探讨其与移植肾急性排斥反应的关系。方法取144例肾移植受者的外周血,通过细胞中白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体启动区21个基因多态性位点,设计寡核苷酸探针58条,进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增、标记、杂交和结果判断。将受者分成急性排斥反应组和无排斥反应组,比较两组受者5种细胞因子及其受体的21个位点的基因型和等位基因分布情况。结果在肾移植受者中,与移植肾急性排斥反应相关的基因型为TNF-α(-308A/A、A/G、G/G)、IL-10(-597A/A、C/C、A/C;-824T/T、C/C、C/T;-1087A/A、A/G)、TGF-β1(+869C/C、C/T、T/T);与移植肾急性排斥反应相关的等位基因为TNF-α(-308A/G)、IL-10(-597A/C;-824T/C;-1087A/G)、TGF-β1(+869C/T)。结论Th1类细胞因子TNF-α能够促进移植肾排斥反应的发生;Th2类细胞因子IL-10和Th3类细胞因子TGF-β1对移植肾急性排斥反应起保护作用。

摘要：目的　构建并表达抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体 ,观察其生物学活性及临床意义。方法　利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术 ,构建抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因 ,测序正确后 ,利用EcoRI和HindⅢ酶切位点 ,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达 ,表达产物纯化后 ,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果　经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为 1 5kb ,序列与设计完全一致 ;SDS PAGE和Western印迹实验证明 :表达产物分泌于细胞培养上清 ,相对分子质量为 6 10 0 0 ;流式细胞仪结果显示 :双特异性单链抗体与PBMC和PC 3细胞的阳性结合率分别为 5 4 1%和 5 3 7%。结论　抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性 ,为进一步的体内实验奠定了基础。

摘要：目的探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA（siRNA）、人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响。方法根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列，分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列（pRNAT—TR—Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ），构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置***—Ⅲ、pRNAT—TERT—Ⅲ（脂质体法）并将其转染BIU-87细胞株，采用荧光定量PCR分析hTR及hTERTmRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖。结果分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后，pRNAT—TERT—Ⅲ，pRNAT—TR-Ⅲ及pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达（分别减少pRNAT—TERT-ⅢTERTmRNA：67％、pRNAT—TR-ⅢTRmRNA：41％、pRNAT—TERT—Ⅲ、pRNAT—TR—ⅢTRmRNA：57％、pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR—Ⅲ TERTmRNA：70％，P〈0．05）。且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制，以联合RNA干扰尤为明显（pRNAT—TERT-Ⅲ：1．80±0．014，pRNAT—TR—Ⅲ：1．95±0．016，pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ：1．25±0．012，P〈0．05）。结论联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长，为其临床应用奠定了基础。

摘要：目的:构建并表达抗人精浆蛋白/抗CD3的双特异性单链抗体(BsscFv),并检测其生物学活性。方法:利用重叠延伸拼接PCR,拼接抗人精浆蛋白scFv基因和抗CD3scFv基因,并在中间引入柔性短肽(GlySerGly)2,构建抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv基因。测序正确后,将融合基因亚克隆入真核表达载体中,并在HeLa细胞中进行表达,采用流式细胞术(FCM)和51Cr释放试验,评价BsscFv的抗原结合活性和体外介导的特异性杀伤靶细胞的效应,以及利用裸鼠前列腺癌模型观察其在体内的抑瘤作用。结果:测序分析证实,Bss-cFv基因片段的大小为1.5kb,编码500个氨基酸,该序列与设计的完全一致。SDS-PAGE和Westernblot分析证明:表达产物存在于HeLa细胞的培养上清中,其相对分子质量(Mr)为61000。FCM结果显示:BsscFv可特异性的结合前列腺癌细胞LNCaP和CD3+淋巴瘤细胞Jurkat,结合率分别为54.1%和53.7%。体外实验表明,BsscFv可介导CTL对LNCaP细胞的杀伤。与对照组相比较,接种LNCaP的裸鼠在体内注射激活的CTL和BsscFv治疗后,肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05)。结论:抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv具有一定的生物学活性,在体内、体外均可介导CTL杀伤靶细胞LNCaP。

摘要：背景:Cylex ImmuKnow检测方法是惟一得到FDA认可的检测移植受者细胞免疫功能的方法,它直接反映细胞免疫的功能,具有灵敏度高、特异性强,结果量化等优点。目的:通过对肾移植后患者监测细胞免疫功能iATP值(intracellular adenosine triphosphatei),分析细胞免疫功能与肾移植术后排斥或感染的关系。方法:140例肾移植受者采用ImmuKnowTM-Cylex方法检测细胞免疫功能,收集数据结合患者临床状态分为排斥组18例,感染组35例与稳定组87例,同时收集61份健康人群血样检测细胞免疫功能数据作对照。分析细胞免疫功能与肾移植患者移植后发生排斥与感染的关系。结果与结论:细胞免疫功能iATP值检测结果显示,感染组患者有71.4%(n=25)分布在低免疫区,同比对照组、稳定组与排斥组比例明显增高(P<0.05)。感染组iATP值显著低于其他3组。说明感染与细胞免疫功能低下两者具有明显的相关性,细胞免疫功能测定对监测肾移植后感染具有显著意义。提示ImmuKnowTM-Cylex方法测定细胞免疫功能为肾移植后并发感染的诊断与治疗提供可靠客观依据,但与肾移植后排斥反应的发生未见明显的相关性,有待于大样本的实验证实。

摘要：目的总结儿童心脏死亡器官捐赠来源单个供肾移植的临床效果与体会。方法回顾分析5例儿童心脏死亡器官捐赠的实施流程与供肾移植资料。儿童捐赠者的年龄为4～9岁，原发病分别为心肺复苏后缺氧性脑损伤1例，重型颅脑外伤2例，脑恶性肿瘤2例。捐赠者中，中国三类4例，中国二类1例。原位灌注、肝肾联合切取获得肾脏10个。结果供者4例行零点穿刺活组织病理学检查，其中1例局灶球性节段性足细胞肿胀、肾小管显著浊肿，肾间质水肿，另3例病理改变轻。获取的10个肾脏均植入受者体内，其中儿童受者3例，成人受者7例，受者体质量为35~69kg，发生移植肾功能恢复延迟2例。术后半年移植肾长径由（7．74±0．68）cm增长为（10．46±0．19）cm。术后发生移植肾动脉狭窄1例，介入动脉扩张和支架植入治疗后痊愈。8例受者随访6个月以上，除1例血肌酐为133μmol／L外，余均波动于正常范围内。随访截止时3例儿童受者肾小球滤过率分别为1．89ml／s、1．78ml／s和1．06ml／s，7例成人受者肾小球滤过率为0．82～1．34ml／s。所有受者均未发生严重肺部感染或尿路感染。结论儿童是公民逝世后器官捐赠的重要潜在捐赠者，但需严格把握脑损伤程度的判断。大于7em的儿童供肾可行单个肾移植，良好的手术技巧与完善的术后管理等是确保移植成功的关键。

摘要：目的 探讨移植肾肾小管周围毛细血管补体片段C4d沉积与抗体介导的慢性排斥反应的病理形态、移植肾功能及预后的关系.方法 应用免疫组织化学技术检测77例肾移植受者移植肾肾小管周围毛细血管中C4d的沉积情况,根据检测结果分为C4d阳性组（35例）和C4d阴性组（42例）.检测并比较C4d阳性和阴性组受者移植肾的病理形态结构、移植肾功能及预后.结果 与C4d阴性组比较,C4d阳性组受者移植肾肾小管萎缩和肾小球基底膜增生分层的例数明显增多,差异有统计学意义（P＜0.05）.C4d阳性组受者的血肌酐水平在移植肾穿刺后12个月时较C4d阴性组受者明显升高,分别为（379.1±260.2）μmol/L和（260.5±175.3）μmol/L,差异有统计学意义（P＜0.05）.C4d阳性组受者移植肾穿刺明确C4d阳性后1年内移植肾存活率为62.9%（22/35）,而阴性组受者为83.3%（35/42）,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 在抗体介导的慢性排斥反应中,移植肾C4d沉积常见的病理学改变为肾小管萎缩和肾小球基底膜增生分层,C4d阳性抗体介导的体液性慢性排斥反应加快了移植肾功能丧失的进展速度,使C4d阳性受者的移植肾功能丧失率升高,导致存活率降低.

摘要：背景:免疫损伤是慢性排斥反应的主要发病机制,与多种免疫相关基因多态性有关,尤其是转化生长因子β1基因多态性更显重要。目前关于转化生长因子β1基因多态性与移植肾慢性排斥反应的关系,不同的学者研究结果各异。目的:分析供、受者转化生长因子β1基因型与移植肾慢性排斥反应的关系。设计:前瞻性病例分析。单位:解放军南京军区福州总医院泌尿外科,全军器官移植中心。对象:选择2000-06/2001-05在解放军南京军区福州总医院首次施行尸肾移植的受者144例和其中114例的供者65例(另30例缺乏供者血液标本)。手术方案得到医院伦理道德委员会批准。方法:用序列特异引物聚合酶链反应方法,在肾移植前对肾移植受者(n=144)和其中114例的供者(n=65)进行转化生长因子β1基因型检测。术后对受者进行5年随访,追踪移植肾慢性排斥反应发生情况,分析受者基因型、供者基因型及供、受者基因型组合对移植肾功能的影响。主要观察指标:①转化生长因子β1不同基因型的肾移植供、受者慢性排斥反应的发生率。②肾移植供、受者转化生长因子β1不同基因型组合慢性排斥反应的发生率。结果:①高分泌基因型组受者的慢性排斥反应发生率高于中低分泌基因型组(χ2=10.091,P0.05)。②供、受者均为高分泌基因型组合的受者移植肾慢性排斥反应发生率高于所有其他基因型组合者(χ2=4.352,P<0.05);供、受者均为中低分泌基因型的受者慢性排斥反应发生率低于所有其他基因型组合者(χ2=4.134,P<0.05)。结论:肾移植术前同时检测移植供、受者转化生长因子β1基因多态性,有助于术前准确预测和评价移植后远期效果,指导术前做出合理的供、受者匹配。