摘要：为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD2v、MGF110-9L基因的多重q PCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对p72、CD2v和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为102copies/mL,敏感性好;组内变异系数为0.03%~0.5%,组间变异系数为0.04%~1.5%,表明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50份临床样品进行检测,结果显示,两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为70%(35/50),符合率为100%。综上所述,本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。

摘要：由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH207.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带,而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5 fg/μL,是普通PCR灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定,可用于病害监测预警。