摘要：根据Caruorhabditis elegans、***和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序列测定结果与推导的ORF序列一致。将该ORF亚克隆到pET-28a(+)载体中,转化大肠杆菌Rosseta,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果分析发现融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清作为一抗,Western blot方法分析天然HcHER-1蛋白,结果发现在全虫抗原的相对分子质量为35×103处出现特异性条带,与其理论大小一致。用荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段和不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示Hcher-1在雄性成虫中表达量最高,虫卵和第3期幼虫其次,在雌性成虫中最低,仅为雄虫表达量的1/7～1/8。

摘要：为了明确透明质酸酶(Hyl)在鱼源无乳链球菌致病过程中的作用,根据Gen Bank上公布的罗非鱼源无乳链球菌Hyl的全基因序列设计引物,采用PCR方法扩增长度为3 156 bp的hyl B基因片段。经限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ消化后克隆至表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-32a(+)-hyl B,经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达。结果显示,137.1 ku的目的蛋白获得成功表达,平板法证实该重组蛋白具有良好的降解透明质酸的活性;用纯化的重组蛋白注射ICR小鼠,病理组织学观察显示,肺和脑组织出现明显的出血和炎性细胞浸润等病理变化。结果表明,Hyl在鱼源无乳链球菌引致肺炎和破坏血脑屏障引起脑膜炎过程中发挥重要作用。

摘要：根据旋毛虫醛缩酶(aldolase,ALD)基因序列设计1对特异性引物,以肌幼虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增肌幼虫的ALD基因。将该基因克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,再将该基因亚克隆到pET-32a(+)载体中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后用SDS-PAGE进行分析。结果显示,该基因与GenBank中旋毛虫醛缩酶基因的相似性高达99%。该基因在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白大小约为57ku,重组蛋白在菌体上清和沉淀中均有存在。Western-blot分析显示,重组蛋白可被人工感染旋毛虫的大鼠血清所识别。通过3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法测定该重组酶的比活性,发现该重组蛋白的最佳反应温度和pH值分别为35℃和7.0。结果表明,该重组蛋白具有一定的抗原性和酶比活性。

摘要：根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白（SzP）、纤维结合素结合蛋白（FNZ）、IgG结合蛋白（ZAG）的基因序列,分别设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246的基因组为模板,扩增szp（527-1 044bp）、fnz（1 012-1 519bp）、zag（134-664bp）基因序列,并构建原核表达载体pET-32a（＋）-szp、pET-32a（＋）-fnz、pET-32a（＋）-zag。确定诱导表达的三种蛋白都具有免疫原性后,通过PCR串联的方法,将以上3个目的片段同时串联克隆到表达载体pET-32a（＋）中。重组质粒转化入大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达分子质量约为74ku的串联融合蛋白SzP-FNZ-ZAG。免疫印迹分析结果表明,上述融合蛋白能够与ATCC35246鼠源多克隆抗体发生结合反应。分别用纯化的单个蛋白和串联重组蛋白免疫ICR小鼠,能够诱导免疫小鼠产生较高效价的血清抗体,串联重组蛋白对致死剂量的马链球菌兽疫亚种强毒菌株的攻击具有90%的免疫保护率,显著高于单个蛋白。RT-PCR检测显示,免疫小鼠IL-4、IFN-γ基因的转录水平显著高于空白对照组小鼠。

摘要：[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。

摘要：根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。

摘要：为制备地昔尼尔乳剂并建立其质量浓度的测定方法,以稳定常数和离心稳定性作为乳剂稳定性评价指标,采用单因素试验和正交设计试验法考察处方因素和工艺因素对乳剂稳定性的影响,以筛选出乳剂的最优处方和制备工艺;采用高效液相色谱法(HPLC)测定乳剂的药物质量浓度。结果显示,地昔尼尔乳剂的最优处方为地昔尼尔50g/L、乳化剂70mL/L、油相125mL/L、助乳化剂160mL/L、稳定剂为3.5g/L;地昔尼尔乳剂的制备方法为乳化温度50℃,20 000r/min高速搅拌10min。建立的HPLC色谱条件为色谱柱X Bridge C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈与水(6mL/L三乙胺+2mL/L甲酸)的体积比为10∶90,流速0.8mL/min,柱温30℃,紫外检测波长267nm,进样体积20μL。在10~100μg/mL的质量浓度范围内,峰面积与药物浓度呈良好线性关系(r2=0.999 9,n=7),回归方程为y=148.01x+91.629。精密度试验相对标准偏差均小于2%,在80%、100%和120%3个添加水平时,平均回收率为98.36%,精密度、回收率均符合要求。定量限和检测限分别为10ng/mL和20ng/mL,测得3批地昔尼尔乳剂的平均质量浓度为49.29mg/mL,为标示量的98.57%。结果表明,该处方合理、制备工艺可靠,所建立的高效液相色谱法可用于地昔尼尔乳剂的检测。

摘要：根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。

摘要：根据基因库中猪圆环病毒 (PCV)的基因序列设计引物 ,建立复合PCR方法 ,对 2株PK 15细胞进行了PCV检测。结果 2株PK 15细胞都可扩增出PCV 1的基因片段 ,其中 1株还扩增得到了PCV 2的DNA片段。由此可见 ,应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的 ,这为PCV的检测。

摘要：为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。