摘要：副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌,传统的鉴定方法费时费力且容易出现假阴性,建立一种定量检测副溶血弧菌基因的方法尤为重要。根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的RealtimePCR方法。通过对9种细菌(12株菌株)的DNA进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线,证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养物品和人工布菌的检测敏感度分别为1CFUPCR反应体系和10CFUPCR反应体系,相关系数均为0.99(r2=0.99),整个试验可在1h内完成。建立的方法可用于海产品中副溶血弧菌的快速定量检测。

摘要：目的:克隆及表达猪链球菌2型(***2)人源分离株Habb截短溶菌酶释放蛋白(MRP)基因。方法:根据***2mrp基因的序列设计引物,克隆和分析江苏海安患者分离株Habb截短mrp基因(tmrp),构建原核表达质粒pGEX4T-2-mrp。在大肠杆菌中诱导带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的融合蛋白tMRP-GST表达;经亲和层析法纯化后,用凝血酶酶切去除重组蛋白中的GST,制备纯化的截短MRP(tMRP)抗原。用Westernblot检测重组抗原的活性。结果:序列分析表明,获得的tmrp基因长957bp;原核表达的融合蛋白tMRP-GST的相对分子质量(Mr)约61000;凝血酶处理的tMRP抗原的Mr约为35000。Westernblot分析显示,MRP-GST、tMRP蛋白均可与MRP多克隆抗血清发生特异性反应。结论:成功地克隆人源分离株Habb截短的mrp基因,并在原核系统实现高效表达,制备的纯化抗原tMRP具有良好的抗原性,为开展相关免疫学研究奠定了基础。

摘要：目的设计了特异性引物对3个致病性猪链球菌2型(Ss2)四川分离株4个主要毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2分别进行了扩增,序列测定与分析结果表明3个Ss2四川分离株均存在4个毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2,其核苷酸序列与1998年江苏分离株9801及国外参考菌株的同源性均大于99.5%,提示3个四川分离菌株与1998年江苏流行的高毒力菌株可能具有共同的来源。

摘要：江苏省某种鹅场15日龄雏鹅疑似感染鸭疫里氏杆菌,无菌采取脑、心脏、肝和脾等病料,进行病原分离纯化,通过细菌生化试验、血清型鉴定及设计特异性扩增鸭疫里氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因的引物,进行PCR扩增,从8份病料中分离到2株血清2型鸭疫里氏杆菌。药物敏感性试验表明,2个分离株对红霉素和阿奇霉素的敏感性高于其他药物。对OmpA基因PCR产物进行基因序列测定,在NCBI上进行基因序列同源性比对,其基因序列与多株已发表的序列的同源性达到99%。进化分析表明,分离株均与D2、G2株具有很近的亲缘关系。

摘要：牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。

摘要：目的克隆、表达猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子基因片段,分析蛋白活性。方法根据GenBank ***2epf基因序列设计引物,克隆ZYH24株epf基因片段并进行序列分析;构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有谷胱苷肽转移酶(GST)标签的融合蛋白EF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白EF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原;SDS-PAGE和Western blot分析诱导表达及纯化的重组蛋白。结果序列分析表明,获得的epf基因片段长895bp;原核表达的融合蛋白EF-GST分子量约62000,凝血酶处理后的EF抗原分子量约35000,两者均可与制备的EF多克隆抗血清发生特异性反应。结论成功克隆了人源分离株ZYH24epf基因片段,在原核系统实现高效的功能性表达,为开展EF蛋白的相关研究奠定了基础。

摘要：根据猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1/2型、7型、9型和14型的荚膜多糖编码基因核酸序列,分别设计猪链球菌种和血清型特异性引物,建立并优化多重PCR检测方法,检测分析种属背景明确的73株菌株(其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株)及临床分离样本94株(包括四川资阳临床分离样本45株)。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5%,6种主要致病血清型检出率可达100%。24株对照菌株在种和血清型检测均为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测,其中41株为猪链球菌2型。上述结果提示建立的多重PCR方法对猪链球菌种及主要致病血清型的检测具有较好的特异性和敏感性,可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。

摘要：提取南京地区经鉴定确诊为犬吉氏巴贝斯虫感染病犬血液中的DNA,设计引物采用PCR方法扩增犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因,克隆至pET-32a质粒中,转化Rosetta-gami(DE3)pLyS大肠杆菌,利用IPTG诱导表达得到重组热休克蛋白(heat shock protein 70,HSP70)。用Ni柱纯化重组HSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并分析重组蛋白的免疫原性及反应原性。本研究成功构建了pET-32a-hsp70重组质粒,IPTG诱导后表达出可溶的重组HSP70蛋白。经过Western blot分析,表达的重组蛋白不但能够免疫小鼠产生抗体,还可以和天然犬吉氏巴贝斯虫抗血清发生特异性反应,为进一步建立犬巴贝斯虫免疫血清学诊断和疫苗抗原的开发奠定基础。

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )基因序列 ,设计两对特异性引物 ,用PCR方法从接种疑似PMWS仔猪病料的细胞中分段扩增 2个分离毒株全基因组。将扩增片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒。对质粒中的插入片段进行测序拼接 ,获得 2株均为 176 8bp的全基因组序列。应用DNAstar序列分析软件 ,对所测PCV 2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行同源性比较 ,并绘制系统发生树 ,结果发现 :所测两毒株之间的核苷酸序列同源性极高 ,可达 99 8% ,亲缘关系密切 ;与PCV 2参考毒株的同源性介于95 3%～ 99 7%之间 ,其中与美国的一株PCV 2同源性最高 ,分别为 99 5 %和 99 7% ,亲缘关系很近 ;与国内两分离株同源性分别为 96 4%和 98 8%～ 98 9% ;与PCV 1参考毒株同源性仅为 77 1%～ 77 5 %。

摘要：根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)的gE、gI基因序列、猪细小病毒(PPV)的E蛋白的基因序列、II型猪圆环病毒(PCV-2)的ORF2基因序列,分别设计并合成3对能特异性扩增PRV、PPV、PCV-2的引物,通过DNAstar软件分析这3对引物不存在cross d im er。建立了PCR方法分别检测PRV、PPV、PCV-2,然后通过条件的优化,建立了PCR同时检测PRV、PPV、PCV-2的方法并研制出试剂盒。对试剂盒的特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性,有效期在-20℃至少可以保存1年。