摘要：为快速诊断和检测猪圆环病毒3型(PCV3),本研究根据其ORF2基因保守序列,设计特异性引物,并通过Bst DNA聚合酶、引物最佳浓度比例、Mg^(2+)、dNTPs和甜菜碱浓度及反应条件优化,建立了环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示,59℃恒温扩增36min即可出现梯形条带,且产物亦可通过SYBR GreenⅠ染色进行判断。该方法最低检测限为1.0×10~1copies·μL^(-1),与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪圆环病毒1型和2型(PCV1、PCV2)等均无交叉反应。检测68份呼吸道病猪淋巴结样品,PCV3阳性率占30.9%,与PCR检测结果符合率为95.6%(65/68)。相对传统PCR方法而言,该方法敏感特异,简便快速,可用于PCV3检测和临床诊断。

摘要：该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。

摘要：设计引物PCR方法克隆了奶牛1926bp的HSP70基因,连接到pGEMR○-T Easy Vector上测序,与NCBI上的序列比对,发现开放阅读框内的点突变(941位点,T→C),致使314位L(亮氨酸)→P(脯氨酸)。DNAstar Protean分析点突变对蛋白的原核表达一、二级结构、等电点进行了分析,结果显示螺旋转角区数目增多,不规则卷曲发生轻微变化,但其它指标均不变。此外,通过DNAstar MegAlign用Clustal V方法分析HSP70家族蛋白的同源性、氨基酸残基替换频率并构建了分子进化树,结果发现碱性、酸性氨基酸(R和K)、分支的氨基酸(V和L)、极性氨基酸(S和T)等在生物HSP70分子进化中氨基酸发生替换的频率最高,HSP70可以作为研究生物系统演化的一个重要的工具。在上述基础上,在HSP70基因上、下游引物分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,构建了pET-32a-c(+)-bHSP70原核表达质粒,IPTG诱导成功得到重组牛源HSP70蛋白,293细胞和Hela细胞的体外实验表明原核表达的蛋白有抗凋亡生物活性[动物学报51(6)1080-1090,2005]。

摘要：本试验旨在研究不同比例青稞秸秆替代苇状羊茅对全混合日粮青贮早期发酵品质及有氧稳定性的影响。试验设对照组(TH0)和3个青稞秸秆不同比例替代组TH_5、TH_(10)和TH_(15)。青贮14d开窖取样,分析其发酵品质、化学成分及微生物数量,将剩余的发酵TMR暴露于空气,用多通道温度记录仪记录温度变化;并分别在有氧暴露的第2,5和8天取样评定其有氧稳定性。结果表明,与对照组(TH0)相比,TH_5的pH、乳酸、乙酸、总挥发性脂肪酸和乙醇含量无显著(P>0.05)差异;TH_(10)和对照相比pH差异不显著(P>0.05),但乳酸、乙酸、总挥发性脂肪酸和乙醇含量显著(P0.05)差异,均以乳酸发酵为主,发酵品质良好。有氧暴露第2天后各组pH和氨态氮/总氮持续上升;乳酸、乙酸和水溶性碳水化合物含量持续下降;酵母菌和好氧细菌数量显著(P<0.05)升高。除TH_(15)外,其他各组温度在第35h开始上升,TH_(15)温度上升延迟,并且温度上升峰值最小。和其他组相比,TH_(15)有氧稳定性最好。综合考虑发酵品质、有氧稳定性及对青稞秸秆资源的最大化利用,建议采用TH_(15)设计配方最为适宜。

摘要：探讨了低盐度胁迫对点带石斑鱼幼鱼消化酶、抗应激酶及幼鱼存活率影响。实验设计了28.23、22.56、17.57、12.67和7.71等5个盐度梯度,实验鱼共40尾(体重20±2.32g),先放入盐度为28.23的水体中驯化10d,然后按以上梯度逐级淡化,在每个盐度梯度维持3d后取样,测定消化酶和抗应激酶等指标,并观察其活动和存活状况。结果表明,胃和肠的蛋白酶、淀粉酶活力随盐度梯度的下降显著降低(P<0.05);肝脏、肌肉和肾脏的SOD活力随盐度梯度下降呈上升趋势,肝脏、肌肉和肾脏的CAT和GSH-Px活力随盐度梯度下降呈降低趋势;鱼的活动能力从盐度梯度为17.57时开始下降,12.67时即出现幼鱼死亡现象,盐度梯度下降到7.71时,幼鱼在12h内全部死亡。说明低盐度胁迫将会严重影响点带石斑鱼幼鱼消化能力并导致鱼体自由基代谢紊乱,应激增强,最终将影响幼鱼健康生长。

摘要：为了探讨玉米不同加工处理方式对新疆双峰驼产奶量及乳品质的影响,选用健康、胎次、泌乳期、产奶量和生理状况基本相近的9岁泌乳骆驼30峰,采用单因子试验设计随机分为3个组,分别饲喂磨碎(对照组)、粉碎(试验Ⅰ组)及膨化压片玉米(试验Ⅱ组)日粮,每组10峰骆驼,每个重复1峰骆驼。每隔2 d记录产奶量,每隔5 d采乳样并测定乳成分含量。结果:试验Ⅰ组和试验Ⅱ组骆驼在0~30 d、31~60 d,0~60 d时日产奶量均显著高于对照组(P<0.05),乳蛋白、乳糖和非脂含量与对照组相比显著升高,但0~30 d及0~60 d时乳脂率与对照组相比显著降低(P<0.05)。试验表明,采用膨化压片玉米和粉碎玉米饲喂双峰骆驼可提高双峰驼的产奶量,以及乳蛋白、非脂和乳糖含量,其中膨化压片处理的效果更好。

摘要：根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60 500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法(P2-ELISA),并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。

摘要：利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列(ZP_02477753)设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因(OMP P2),并克隆到载体pMD18-T(T-Vec-tor),序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。

摘要：【目的】通过对巴什拜羊SNPCLPG的分子检测,期望发现CLPG基因型种羊,为今后选育肉用性状更优异的新品系奠定基础。【方法】绵羊的双肌臀(Callipyge,CLPG)基因表型为后臀肌肉增大近30%,是由位于绵羊18号染色体GTL2基因上游32.8 kb处1个A→G的单核苷酸多态性(SNP)标记(命名SNPCLPG)突变所产生的。为此,选择设计合成了1对引物,采用聚合酶链式反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)方法,以巴什拜羊作为研究样本,进行了SNPCLPG位点的PCR检测。【结果】获得了预期的扩增片段,并检测到了基因多态性,但未检测到CLPG基因型特征的SNPCLPG突变(A→G)。【结论】被检测的巴什拜羊群体中该区域没有发现A→G的单核苷酸多态性标记突变。

摘要：旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。