摘要：用大肠杆菌感染中国家蚕(Bombyx mori)蛹,从中提取总RNA,用RT-PCR方法获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA部分片段并克隆测序,以此蚕抗菌肽基因CBM1的部分片段,设计特异性引物,用3′、5′RACE的方法,获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA的全长序列;用PCR的方法,从中国家蚕蛹基因组DNA获得抗菌肽CBM1基因的700 bp、1 100 bp左右的2个片段,初步证实中国家蚕抗菌肽基因在单倍体染色体中至少存在2个拷贝。

摘要：根据所测定的中国产家蚕CBM1和CBM2cDNA序列,设计成熟肽的特异性引物,将此基因与凝血因子Ⅹa(FⅩa)的切割序列以PCR方法连接起来,克隆至pGEX-KG表达质粒中。该载体为改进的GST融合表达质粒,所携带的6个Gly有助于提高FⅩa的切割效率。克隆得到的融合载体在大肠杆菌JM109中扩增和筛选。经DNA测序,证实为含有正确序列的乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-NCBM1(pKG-FⅩa-NCBM1)、非乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-CBM1(pKG-FⅩa-CBM1)和乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-NCBM2(pKG-FⅩa-NCBM2)、非乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-CBM2(pKG-FⅩa-CBM2)。将该载体在BL21中诱导表达,得到GST-FⅩa切割位点NCBM1、CBM1、NCBM2、CBM2等4种融合蛋白。经SDS-PAGE,考马斯亮兰染色后,Lab-Work扫描,其表达产物达到15%～20%,每升培养液平均可得20mg融合蛋白。菌体总蛋白经GST-亲和层析柱得到纯的GST-FⅩa-NCBM1、GST-FⅩa-CBM1、GST-FⅩa-NCBM2、GST-FⅩa-CBM2融合蛋白,再经FⅩa酶切后,透析过柱得到重组的NCBM1和CBM1。平板抑菌试验证明,4种融合蛋白均有明显的生物学活性,且没有显著的差异。