摘要：目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性。方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt)。用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达。采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫。用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞。结果:opt和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型。opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠。结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性。

摘要：目的评价国产阿德福韦酯(ADV)治疗慢性乙型肝炎和拉米夫定治疗后发生YMDD突变耐药的慢性乙型肝炎患者48周的疗效和安全性。方法采用多中心、随机、双盲、安慰剂平行对照的研究设计。分甲、乙两组,甲组为乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎组,乙组为拉米夫定治疗后发生YMDD突变耐药的慢性乙型肝炎组。甲组第一阶段227例患者随机进入ADV组(A组,112例)或安慰剂组(B组,115例)双盲治疗12周,分别口服ADV 10mg或安慰剂1粒,1次/d；第二阶段患者均接受开放的ADV治疗36周。乙组第一阶段57例患者随机进入拉米夫定+ADV组(C组,28例)或拉米夫定+安慰剂组(D组,29例)双盲治疗12周,分别口服拉米夫定100mg+ADV 10 mg或拉米夫定100 mg+安慰剂1粒,1次/d；第二阶段患者均停服拉米夫定,接受开放的ADV治疗36周。主要疗效评估指标为血清HBV DNA的变化情况,次要疗效评估指标为丙氨酸氨基转移酶的复常率与HBeAg转阴率、HBeAg的血清转换率。结果治疗12周时,A组和B组HBV DNA中位数水平较基线分别降低了2．8 log10拷贝/ml和0．3log10拷贝/ml(P=0．000)；C组和D组HBV DNA中位数水平较基线分别降低了3．0logl0拷贝/ml和0．16 log10拷贝/ml(P=0．000)。治疗48周时,A组和B组HBV DNA中位数水平较基线分别降低了3．6log10拷贝/ml和3．4log10拷贝/ml,两组降低程度相似；C组和D组HBV DNA中位数水平较基线分别降低了3．6log10拷贝/ml和3．8log10拷贝/ml,两组降低程度相似。安全性方面,与药物可能相关的不良事件的发生率为5．56%(16/288),均为轻、中度。研究期间各组血清肌酐水平同基线相比无变化。结论ADV 10 mg/d服用48周．能安全有效地治疗初治和拉米夫定治疗后发生YMDD突变耐药的慢性乙型肝炎患者。

摘要：目的:通过技术流程管理和感染控制方法探索,以减少丙型肝炎HCV新感染病例。方法:将132例血液透析患者分为3组,A组27例为血液透析≤1年者;B组71例为血液透析1～5年者;C组34例为血液透析>5年者。检测血液透析患者抗HCV抗体及HCV-RNA滴度,分析与血液透析时间、方式、使用血液制品几率、是否采用复用透析器等因素的关系。结果:剔除输血和复用透析器的影响,HCV感染几率与透析时间长短呈正相关即当透析时间每增加一个等级时,抗HCV转阳率将平均增加2.99倍。HCV-RNA滴度提高一个几何级数的可能性将平均增加1.29倍。结论:制订一系列感染控制措施和规章制度,特别是透析器复用环节RC接头的使用,复用机设计新观点,以及血液透析区域中间清场制等有效对策,可控制HCV新感染病例。

摘要：目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默IKK/NF-κB信号通路对肝星状细胞株HSC-T6细胞增殖的影响。方法根据GenBank数据库IKKβ的c DNA序列,设计构建合成IKKβsiRNA,采用阳性脂质体转染,设立空白对照组、阴性对照组及实验组,采用MTT法测定IKKβsiRNA转染后24、48、72 h细胞的相对数量及活力,流式细胞仪测定细胞周期的变化。结果 (1)与空白对照组和阴性对照组相比,实验组不同时间HSC-T6细胞增殖均受到明显抑制(P<0.05),且这种抑制效应具有时间依赖性;(2)流式细胞仪检测发现实验组G0/G1期细胞比例增多,S期与G2/M期细胞则显著减少(P<0.05)。结论 siRNA沉默IKK/NF-κB信号通路能够明显抑制HSC-T6细胞的增殖,这种抑制作用是通过改变其细胞周期来实现的,具有潜在的逆转肝纤维化的治疗作用。

摘要：目的:针对目前结核性疾病实验室诊断的局限性,探索一种更为敏感和特异的结核分枝杆菌DNA检测新方法。方法:选取10株江苏地区流行的结核分支杆菌(MTB)菌株,选取临床其他常见菌株及分枝杆菌菌株作为对照组,分别提取DNA作为随机引物的模板。参考国内、外文献设计12条随机引物,并分别对MTB及对照菌株进行单个引物随机扩增,2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离并切胶纯化,通过TA克隆将纯化片段连接到质粒pEASYTM-T5 Zero并进行测序,通过BLAST-nr比对验证是否为MTB DNA片段。按照所确定的MTB片段序列,在其内部设计、合成一对特异性引物。用此特异性引物扩增对应的随机引物扩增产物,获得MTB特异性条带图谱。并将该方法检测的敏感性和特异性与临床上常用的real-time PCR进行比较。结果:经BLAST-nr比对,随机引物IS986F,S535及IS986R扩增的条带与MTB DNA有高度同源性(均为99%)。随机引物IS986F、S535和IS986R分别联合其特异性引物可以检测稀释105倍、105倍和103倍的MTB DNA,其特异性分别为100%、90%和80%。常规real-time PCR可检测出稀释104倍的MTB DNA。结论:随机引物IS986F联合其特异性引物检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性优于S535、IS986R两组,特异性为100%,且灵敏度优于常规real-time PCR法。

摘要：目的研究小干扰RNA(siRNA)沉默IKK/NF-κB信号通路对于肝星状细胞株HSC-T6凋亡的影响。方法根据Gen Bank数据库IKKβ的c DNA序列,设计构建合成IKKβsiRNA,采用阳性脂质体转染,设立空白对照组、阴性对照组及siRNA实验组,采用TUNEL法和流式细胞仪Annexin-V/PI双染法测定IKKβsiRNA转染后24 h、48 h和72 h细胞凋亡率,同时采用Western blotting检测NF-κB P65、Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表达情况。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组24 h、48 h和72 h HSC-T6细胞凋亡率均显著增加(P<0.05),且具有时间依赖性;实验组的NF-κB P65及Bcl-2蛋白的表达均明显升高,而Caspase3和Bax则显著增加,与空白对照和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SiRNA沉默IKK/NF-κB信号通路能够下调NF-κB P65的表达,同时提高Bax和Caspase3的表达,促进HSC-T6凋亡,这种肝星状细胞凋亡诱导效应具有潜在的逆转肝纤维化的治疗作用。

摘要：目的结合随机扩增多态性技术(RAPD)和荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR)的优势,建立快速、准确地检测结核分枝杆菌的新方法。方法根据国内外文献设计随机引物,以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv为模板进行RAPD,产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取条带进行割胶纯化测序,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序上进行同源性检索,结果和结核分枝杆菌匹配率都达到99%。设计特异性内引物和探针,以RAPD产物为模板进行qPCR,并优化反应条件。分别以10倍梯度稀释的一系列浓度的H37Rv和其他阴性对照菌为模板,进行qPCR和RAPD-qPCR,分析其灵敏性和特异性。结果 qPCR能够检测到30pg/μl的结核分枝杆菌,而RAPD-qPCR灵敏性提高到3fg/μl。而且RAPD-qPCR检测30pg/μl至30fg/μl的结核分枝杆菌核酸时,扩增得到的Ct值都较小[(6.58±0.19)^(14.95±0.36)],结果稳定,易于判断。qPCR和RAPD-qPCR检测其他临床常见的细菌均呈现阴性。结论 RAPD-qPCR是一种快速、准确地检测出结核分枝杆菌的新方法。

摘要：目的:建立一种随机扩增多态性技术(RAPD)联合荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)高敏定量检测单纯疱疹病毒(HSV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)的新方法。方法:根据文献筛选出数十条随机引物,分别对三种疱疹病毒进行随机扩增,产物经2%琼脂糖凝胶电泳,选取稳定清晰条带进行分离、纯化及克隆测序,应用blast-nr比对genebank现有病毒序列,选取高于99%匹配度的基因序列作为目的片段,并在其内部用primer3.0设计特异性内引物。经过引物筛选及条件优化后建立RAPD联合q PCR检测新方法,分别检测三种疱疹病毒。结果:经过筛选,确定了HSV、HCMV、VZV扩增灵敏性及特异性最好一组引物,建立的RAPD-q PCR可分别检测出1:10~6 HSV、1:10~5 HCMV和1:10~5 VZVDNA,而单一q PCR仅能检测1:10~3 HSV、1:10~2HCMV和1:103 VZVDNA。RAPD-q PCR相比于单一q PCR灵敏性提高100-1000倍,RAPD-q PCR扩增大于1:10~5病毒DNA得到的CT值均小于22.96±0.81,与10~2 copies/μL的标准线相距远,易于区分阴性和阳性。此外,用乙型肝炎病毒及疱疹病毒互为对照未见非特异扩增,特异性好。结论:随机扩增多态性技术联合荧光定量是一种检测三种病毒高度灵敏及特异的检测方法。

摘要：目的探讨家庭环境对学龄前儿童发育性协调障碍(DCD)的影响。方法按分层随机整群方法抽取4~6岁儿童1 727例,应用"儿童运动协调能力成套评估工具"对其进行DCD筛查;采用"城市学龄前儿童运动发育家庭环境量表"及自行设计的问卷评估儿童家庭环境状况。结果 117例儿童确诊为DCD。DCD组和正常对照组儿童在母亲文化程度、家庭结构的比较中差异有统计学意义。家庭环境因素中"让孩子管理自己的日常物品"和"包办孩子一切事务"两项得分在DCD组和正常对照组儿童之间差异有统计学意义。在控制儿童性别、年龄情况下,多因素logistic回归分析显示,"母亲文化程度""家庭结构""让孩子管理自己的日常物品"及"包办孩子一切事物"是影响儿童DCD发生的主要因素(均P<0.05)。结论家庭环境对学龄前儿童DCD的发生存在影响,家长在养育孩子的过程中,不要包办孩子一切事务,应为儿童提供更多的管理自己日常生活的机会,以促进其早期运动协调能力的发展,预防DCD的发生。

摘要：目的通过与阳性药物复方甘草酸苷比较，观察异甘草酸镁注射液治疗ALT升高的慢性肝病的临床疗效和安全性。方法多中心、随机、双盲、多剂量、阳性药物平行对照的试验设计，480例患者随机进入异甘草酸镁100mg／d剂量组（A组，180例）、150mg／d剂量组（B组，180例）和阳性药复方甘草酸苷对照组（C组，120例）。试验A组：异甘草酸镁注射液100mg加入到10％葡萄糖注射液250ml中静脉滴注，1次／d；试验B组：异甘草酸镁注射液150mg加入到10％葡萄糖注射液250ml中静脉滴注，1次／d；对照组：复方甘草酸苷注射液120mg加入到10％葡萄糖注射液250ml中静脉滴注，1次／d。疗程为4周，停药2周后随访。治疗前、治疗第2周、第4周和停药后2周观察症状、体征及ALT、AST变化情况；治疗前、治疗第4周观察其他肝功能指标。采用t检验分析计量资料，Fisher确切概率法分析计数资料，Wilcoxon秩和检验分析等级资料。组内疗效指标比较采用非参数的符号秩和检验方法，组间疗效指标比较采用中心效应的方差分析法或CMH方法。结果412例患者按方案完成研究，其中A组152例，B组160例，C组100例。治疗2周和4周后，三组患者ALT、AST水平均明显下降（P值均〈0．05）；治疗2周时的ALT下降幅度，B组明显大于C组（P〈0．01），治疗4周时ALT下降幅度三组间差异无统计学意义（P〉0．05）。治疗4周后，A、B、C组ALT改善的总有效率分别为92．59％、91．76％、88．29％，差异无统计学意义（P〉0．05）。4周后，A、B、C组的临床总有效率和总体疗效的总有效率分别为90．41％、89．86％、86．46％和72．22％、73．53％、68．47％，三组间差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。停药后，三组患者均无明显反跳。三组患者的不良反应发生率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论异甘草酸镁注射液可以安全、有效地治疗ALT升高的慢性肝病。