摘要：目的设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体。探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆。以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型。大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次。小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数。ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1(+)的XbaI和EcoR I酶切位点之间,命名为pcRz-ESG-2A。在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势。核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%。结论成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用。

摘要：目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。

摘要：目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。

摘要：衣原体疫苗接种的最终目的是刺激机体体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫应答的有机结合,以发挥抗感染保护作用、减少炎症病理的形成。衣原体抗原成分单独接种或与佐剂联合应用均不能全面激发机体的免疫应答。纳米粒子因具有降低毒副作用、靶向输送、缓释、避免被酶降解、提高活性和稳定性等独特优势,为衣原体疫苗设计提供了新策略。应用于医学领域的纳米材料种类繁多,衣原体纳米疫苗已取得一定程度的进展,本文主要对纳米粒子脂质体和多聚体微粒在衣原体疫苗中的研究进展作简要概述。

摘要：目的检测鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，c加）蛋白酶样活性因子（cMamydial protease-likeactivity factor，CPAF）免疫优势区基因在*** B121中高效表达的产物在印5感染诊断中的应用，为建立印s感染的快速诊断奠定实验基础。方法利用生物信息学软件筛选出CpsCPAF免疫优势区基因序列（CPAFm，A196～A450），设计特异性引物，PCR扩增目的基因，将其克隆入pGEX6p-2载体后转化***121，利用IPTG诱导表达重组蛋白，Westernblot鉴定重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立血清学诊断的间接ELISA法；同时用商品ELISA试剂盒与建立的间接ELISA法检测180份可疑Cps感染的病鸭血清标本，将检测结果进一步用Westernblot方法验证。结果构建原核重组质粒pGEX6p-2／Cps CPAFm，表达相对分子质量约为54×10^3的目的蛋白产物。以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法检测Cps参考血清，其阴、阳性符合率均为100％；与肺炎嗜衣原体（***-moniae，印n）、沙眼衣原体（***，Ct）无交叉反应。对180份可疑病鸭血清标本进行检测，与商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒比较，以Westernblot方法作对照，自建的ELISA法符合率均为100％，Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率为77．5％～95．0％。结论以Cps CPAF免疫优势区（A196～A450）作为诊断抗原，建立血清学诊断的间接ELISA法具有较好的临床诊断价值。

摘要：目的纯化铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)溶血素共调节蛋白(Hemolysin co-regulated protein,Hcp)并制备抗血清。方法从NCBI网站查到铜绿假单胞菌Hcp蛋白序列,采用Signal IP 4.1预测定位及信号肽情况;登录Swiss model网站预测三级结构情况;登录***网站预测其B细胞表位。根据Hcp基因序列设计特异性引物,以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增Hcp基因,经双酶切后连到pET28a。将重组质粒pET28a-Hcp转化大肠埃希菌BL21(DE3),然后用IPTG诱导重组Hcp蛋白表达。使用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。用Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗血清效价。结果 Hcp定位在细菌细胞浆,无信号肽,6个单体蛋白组成一个环状的中空结构,含有多个B细胞表位。构建的表达质粒pET28a-Hcp能表达23.9×10~3大小的Hcp蛋白,镍柱层析后得到高纯度的Hcp蛋白,重组Hcp蛋白诱导的抗体效价大于1∶10 240。结论成功重组表达铜绿假单胞菌Hcp蛋白及高滴度的抗血清,为研究Hcp的功能奠定了实验基础。

摘要：沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的病原体,也是最常见的性传播疾病病原体,可感染人类多个系统引起多种疾病而影响人类健康。沙眼衣原体具有独特的发育周期,黏附和入侵宿主细胞是它感染过程中的关键步骤,首先通过与宿主细胞的静电作用达到简单吸附,随后由自身黏附素分子与宿主细胞相应受体结合达到不可逆结合,而后通过分泌毒力因子劫持宿主细胞骨架的必需成分或信号通路内化入胞。病原体和宿主因素共同参与沙眼衣原体黏附和入侵过程,掌握黏附和入侵过程中有关的细菌和宿主因素有望设计针沙眼衣原体的抗菌策略。本文从宿主和病原体两个方面阐述沙眼衣原体黏附和入侵宿主相关机制。

摘要：衣原体是一类专性胞内寄生、多宿主病原体,可感染眼部粘膜、呼吸道、泌尿生殖道等,引起人类与动物多种感染性疾病及并发症。然而衣原体常呈隐匿性感染,潜伏期长,临床上仅呈现轻微症状甚至无症状,抗生素治疗后常出现感染反复持续、迁延难愈现象,对人类公共卫生和畜牧业造成严重威胁。因此,研发安全高效的衣原体疫苗是防治衣原体感染的重要手段。mRNA疫苗是近年新兴的疫苗,在抗病毒、抗传染性疾病病原体方面应用广泛。过去几十年疫苗的研究显示,与全菌疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫苗相比,mRNA疫苗不仅在安全性、免疫性、灵活性等方面更具优势,在传染病的预防方面也具有强大潜力。我们通过总结近年来衣原体疫苗以及mRNA疫苗的相关研究和重要发现,系统介绍合理研发衣原体mRNA疫苗过程中衣原体抗原选择、佐剂选择、抗原递送及免疫途径等重要环节及注意事项,为研发安全有效的衣原体mRNA理想疫苗提供设计思路和理论依据。

摘要：目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因,构建pGEX-6p-2/Pmp21原核表达载体。方法筛选Pmp21优势抗原表位,PCR法扩增Pmp21目的基因;并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体;经PCR与测序鉴定。结果软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列,设计引物PCR法扩增得到目的片段;构建重组质粒经测序鉴定,BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致。结论成功构建pGEX-6p-2/Pmp21载体,为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础。

摘要：衣原体(Chlamydia)是一种专性胞内寄生菌,衣原体的反复感染及其诱发的严重后遗症是人类健康的巨大威胁,因此,迫切需要开发安全有效的疫苗来预防和控制衣原体感染。尽管人类在衣原体免疫保护机制的研究和疫苗开发方面已经取得了一定的突破,但是结合疫苗安全性和免疫效果的全面考量,有效衣原体疫苗的成功出世仍然面临很多问题。本文就疫苗免疫效果的影响因素、合理设计有效衣原体疫苗的要素以及减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、树突状细胞(dendritic cells,DC)疫苗和菌影(bacterial ghost,BG)疫苗等衣原体疫苗的研究现状进行简要论述。