摘要：目的构建带c-myc分子标签的人三叶因子家族2(hTFF2)融合基因c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体,以便进一步构建能表达活性c-myc-hTFF2融合蛋白的乳酸链球菌工程菌。方法根据hTFF2的氨基酸表达序列和乳酸链球菌的氨基酸密码子,以c-myc作为分子标签,设计c-myc-hTFF2的cDNA序列,并在其5'端和3'端添加SalI和BamHI酶切位点;将目的基因片段设计成14个相互互补的寡核苷酸,经聚合酶链式反应,得到目的基因c-myc-hTFF2;将c-myc-hTFF2连入pBluescriptIIsk(+)载体,构建其克隆载体pBS-TFF2并进行酶切鉴定及DNA测序;分别用SalI/BamHI和XhoI/BamHI对pBS-TFF2和pNBC1000进行双酶切反应,再通过连接反应将c-myc-hTFF2融合基因插入pNBC1000,构建c-myc-hTFF2大肠杆菌表达载体(pNTFF2);用XbaI对pNTFF2和穿梭载体pTRKH2单酶切反应,并通过连接反应将c-my-hTFF2的表达载体连入穿梭载体pTRKH2,完成乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建,并进行酶切鉴定。结果成功构建了c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体pTRTFF2。结论体外基因拼装是构建目的基因有效的方法;pTRTFF2的构建为构建乳酸链球菌工程菌奠定了基础。

摘要：目的向大肠癌细胞Lovo中导入靶向survivin基因的siRNA,研究其对Lovo细胞生物学效应影响。方法设计2条特异性靶向survivin基因的siRNA,体外转录法合成,通过脂质体导入Lovo细胞并检测转染后细胞内survivin基因表达水平及凋亡、增殖情况。结果细胞内survivin mRNA表达水平降低,细胞凋亡率升高,增殖能力减弱。结论所设计的靶向survivin基因的siRNA能有效降低目的基因的mRNA表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞生长。为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据。

摘要：目的构建galectin-1基因特异小分子干扰RNA(siRNAs)真核干扰载体,并获得干扰载体稳定转染的LST-R1细胞系。方法设计2对galectin-1 mRNA(GenBank:NM002305)特异性siRNAs,两端分别带有BamHⅠ/HindⅢ酶切位点和一个9nt的发夹结构,通过基因克隆技术将其插入真核表达质粒pSUPER-puro中,构建galectin-1 siRNA表达载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证重组载体的正确性。将重组载体与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,以嘌呤霉素(0.8μg/ml)进行阳性克隆筛选。四环素(4μg/ml)诱导48h后,RT-PCR检测galectin-1 mRNA表达水平,Western blotting和细胞免疫化学方法检测galectin-1蛋白质水平的变化。结果测序表明galectin-1 siRNA真核表达载体p-shRNA1和p-shRNA2干扰序列与读码框相符。p-shNRA1和p-shRNA2与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,获得稳定的重组质粒转染细胞p-shRNA1-LST和p-shRNA2-LST。RT-PCR显示,galectin-1 mR-NA在LST-R1细胞、p-shRNA1-LST细胞、p-shRNA2-LST细胞以及p-LST细胞中的表达量分别为0.616、0.298、0.373和0.641,以p-shRNA1-LST的干扰效果最好。Western blotting结果显示,在LST-R1、p-shRNA1-LST、p-shRNA2-LST和p-LST细胞中galectin-1的表达量分别为1.00、0.07、0.38和0.97,以p-shRNA1-LST干扰效果最好,与免疫细胞化学的结果一致。结论成功构建了galectin-1真核干扰载体,RNAi载体转染LST-R1细胞系的建立为进一步研究galectin-1在大肠侧向扩散型肿瘤中的作用奠定了实验基础。

摘要：目的:构建galectin-3shRNA真核表达载体,观察该基因的抑制对大肠癌细胞系lovo细胞增殖率的影响.方法:以未转染lovo细胞作为阳性对照组,转染空质粒的lovo细胞作为阴性对照组,将针对人galectin-3基因的不同部位设计的长度约140bp的shRNA,插入到真核表达载体PRNAT-U6.1并转染人大肠癌细胞lovo,双酶切鉴定重组载体,免疫荧光检测转染效果,RT-PCR和Western-Blot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制,MTT测定干扰后对lovo细胞增殖率的影响.结果:双酶切出一条约120bp的DNA片断,与插入片断长度相符.PRNAT-U6.1/Galectin-3shRNA表达载体顺势转染lovo细胞72h后检测转染效率及Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达情况,免疫荧光检测转染效率为62%.转染PRNAT-U6.1/Galectin-3shRNA的lovo细胞Galectin-3的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,各组间比较F=2.214,148.566,P=0.000,0.000,阴性组和阳性对照组相比,P=0.448,0.263.干扰后细胞继续生长,与干扰前相比,生长明显减慢,F=20.830,P=0.000,组间比较F=149.710,P=0.000,shRNA干扰组与阴性组和阳性组比较,P=0.000,0.000.结论:成功构建Galectin-3shRNA表达载体,干扰后Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达明显降低,Galectin-3表达的抑制可能会导致大肠癌细胞lovo增殖率的降低.

摘要：目的建立一种快速准确的方法对引起腹泻的常见肠道致病菌做初步筛查,并对早期治疗和最后诊断起指导作用。方法培养大肠埃希氏菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、志贺菌、伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、普通变形杆菌等的标准菌株。根据生物信息学技术设计以16S rRNA序列为靶基因设计各细菌的特异型探针和引物。待测细菌经Cy5标记后的引物以不对称PCR方法扩增后,与固定探针的芯片进行杂交。然后用荧光扫描仪扫描,判定细菌的种类。结果我们建立的针对16S rRNA序列的基因芯片检测系统能够成功地将14属的细菌鉴定到属。在纯培养物的最低检测浓度为103CFU/mL。结论我们所建立的基因芯片系统具有高通量和高准确性,可以作为临床鉴定细菌的一个重要的工具。

摘要：目的:利用pGenesil-1质粒构建靶向survivin基因的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2对shRNA,GC比在40%～55%之间,进而应用BLAST软件进行同源性剔除,保证所得shRNA序列靶向survivin基因,分别克隆至带有U6启动子的质粒pGenesil-1中,构建质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。双酶切重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向survivin基因的2个shRNA质粒表达载体,经双酶切鉴定及质粒测序结果完全符合设计要求。结论:经鉴定设计的2条shRNA已成功连接于质粒上,可以应用于进一步RNA干扰试验。

摘要：背景:肝卵圆细胞具有强大的自我更新复制及在一定的条件下克隆增殖并分化为成熟肝细胞的能力,既可在体外用于构建生物人工肝的生物材料部分,也可以进行体内移植,还可为组织工程提供种子细胞,在治疗肝病方面具有广阔的前景。目的:建立成年Wistar大鼠肝卵圆细胞增殖模型,行体外分离和培养肝卵圆细胞,探索体外诱导其分化为肝细胞的可行性。设计:观察性实验。单位:南方医科大学南方医院消化病研究所。材料:实验于2003-12/2006-02在南方医院消化病研究所实验室完成。36只三四个月龄,其阳性率逐渐升高。④细胞化学方法显示诱导分化细胞胞浆G-6-P染色呈棕黑色沉淀,PAS染色呈红色颗粒。结论:乙硫氨酸灌喂联合2/3肝切除可复制成年Wistar大鼠的肝卵圆细胞增殖模型。胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化可获得满意的肝卵圆细胞。大鼠肝卵圆细胞能在体外传代培养,在一定条件刺激下可诱导分化为肝细胞。

摘要：目的采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建galectin-1基因特异siRNAs真核干扰载体,检测LST-R1细胞galectin-1表达变化,观察黏附LST-R1细胞增殖和凋亡改变。方法设计2对galectin-1基因特异性siRNAs,确定相应的shRNAs,通过基因克隆技术将其插入真核表达质粒***,构建galectin-1 siRNA表达载体,与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,嘌呤霉素(0.8μg/mL)进行阳性克隆筛选。四环素(4μg/mL)诱导48 h后,RT-PCR检测galectin-1 mRNA水平改变,免疫印迹和细胞免疫化学检测蛋白质水平的改变,观察黏附LST-R1细胞增殖和凋亡改变。结果成功构建发夹样galectin-1 siRNA真核表达载体p-shRNA1和p-shRNA2,建立相应稳定的p-shRNA1-LST、p-shRNA2-LST细胞系。RNAi下调galectin-1表达后,细胞生长曲线表明第3至7天黏附p-shRNA1-LST细胞增殖较p-LST和LST-R1细胞增加,而低浓度血清诱导的细胞凋亡则减少,依次为(3.77±0.34)%、(7.92±0.60)%和(7.67±0.75)%(P<0.001)。结论Galectin-1的下调表达可抑制黏附LST-R1细胞凋亡,同时促进黏附LST-R1细胞增殖,提示galectin-1可能参与了LST病变浅表性扩散特性的形成。

摘要：目的:合成靶向survivin基因的shRNA并构建pGenesil-1-shRNA质粒表达载体,研究其对大肠癌Lovo细胞生物学效应的影响。方法:设计2条特异性靶向survivin基因的shRNA,与pGenesil-1质粒载体连接,导入大肠癌Lovo细胞、筛选稳定细胞株,Western Blot检测蛋白表达,流式细胞技术检测细胞生长周期,MTT法描绘细胞生长曲线。结果:筛选的稳定表达细胞内survivin蛋白的表达水平降低,survivin基因低表达的Lovo细胞停滞于G2/M期从而导致细胞生长速度减慢。结论:靶向survivin基因的shRNA能有效降低survivin基因在体内的表达,抑制大肠癌细胞的生长,为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据。

摘要：目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。