摘要：目的:构建shRNA的表达载体,检测针对乙型肝炎病毒(HBV)的shRNA的稳定表达质粒对HBV复制和表达的影响。方法:扩增U6启动子构建shRNA表达载体pU6。针对HBV基因组序列设计并化学合成双链核苷酸克隆到pU6载体得到质粒pU6B/HBVi,脂质体介导转染带有HBV基因组的2.2.15细胞,定量PCR和ELISA法检测pU6B/HBVi对HBV复制和表达的影响。结果:成功构建了shRNA的真核表达载体;针对HBV的pU6B/HBVi质粒对HBV的复制和表达有明显的抑制作用。结论:稳定表达shRNA的pU6B/HBVi质粒可以抑制HBV在2.2.15细胞中的复制和表达。

摘要：在分析连续位匹配规则基础上提出了特征值匹配的概念,通过对特征值比较代替传统匹配方式,实现了阴性算法的改进.引入主要组织相容复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)特征判别概念,在分析黑洞特性以及与非检测器集合关系的基础上,设计MHC检测滤窗作为检测器之后的更高级别安全防护层,以彻底杜绝黑洞模式的侵入,真正意义上消除黑洞这一危险检测漏洞.仿真结果表明,使用MHC独立检测滤窗成功地发现了所有检测器未能阻击的黑洞模式,确保了外来模式检测的准确性和安全性,而其检测时间和对系统资源的占用并未因此而显著增加.

摘要：设计商业智能系统,分别构建ETL模块、数据仓库和OLAP系统。对于Cube中经常出现的异常数据问题,提出使用人工免疫系统进行检测,将Cube查询的KPI历史数据进行二进制编码作为自我集合,并用阴性选择算法产生检测器。设计基于人工免疫检测的新商业智能系统,测试表明,改进的系统可以有效地检测异常数据的存在,从而保障了最终用户端使用数据的准确性和整个商业智能系统的可靠性。

摘要：目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。

摘要：目的研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(Tm)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果与结论获得22条60 mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。

摘要：目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染siRNA后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。

摘要：目的制备病毒性肝炎联合诊断cDNA芯片,并进行系列优化及临床应用性研究。方法对于基因组较小的HBV、HDV病毒,采用PrimerPremier5.0软件针对其保守区域设计特异引物,普通PCR技术制备探针;利用限制性显示PCR(RD-PCR)技术制备基因组较大且复杂的HCV芯片探针。为了便于摸索实验条件和更好地进行探针优化,先后制备3种芯片,包括HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片及HBV、HDV、HCV联合诊断芯片。结果杂交结果显示HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片的诊断效果较为满意。从以上2种芯片中选取探针制备HBV、HDV、HCV联合诊断芯片,并对该芯片的检测质量进行初步评估:①检测线性:病毒质粒拷贝数在104～1011copies/ml之间时,芯片检测法显示了较好的线性(r分别为0.9902、0.9921、0.9819,P<0.01);②特异性:检测黄热病病毒(YFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、登革热病毒(DV)等其他病毒样品结果均为阴性,说明该芯片特异性较好;③重复性:检测HBV、HDV、HCV的批内精密度变异系数(Cv)值为7.1%、7.2%、6.6%,批间精密度Cv值为7.9%、8.2%、7.6%;④准确性:将HBV、HDVPCR片段(共14条)、HCV限制性片段(24条)和部分临床阳性血清(PCR产物)全部进行序列测定,在GenBank中进行Blast比较,结果表明克隆基因均属于相应基因,与理论一致。为了适应临床诊断的要求,对实验条件进行优化,包括减少杂交时间、取消预杂交、将杂交温度提高到52℃等措施。在实验室对芯片进行初步评估后,对临床血清标本进行小规模批量检测实验:用芯片法和实时定量PCR法检测HBV阳性血清(98例)、HCV阳性血清(42例)和阴性血清(130例),对两种方法进行对比,结果显示芯片法检测与实时定量PCR法有良好的相关性(HBV、HCV的r值分别为0.9854和0.9582),检测HBV、HCV、HDV的敏感性和特异性分别为85.7%、76.2%、80.0%和96.7%、95.0%、100%。结论本研究研制的联合诊断芯片敏感性、特异性均较佳,临床应用前景较好。

摘要：目的:构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽基因Tat的融合表达载体,以大肠杆菌作为表达系统,探索制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗的新方法。方法:以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与原核表达载体pET28a连接,重组质粒再与自行设计蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入大肠杆菌表达菌株DE3进行诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白。结果:融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,结果诱导表达成功。结论:本研究为制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗打下了基础。

摘要：目的:通过生物信息学软件对易引起慢性肝炎的三种肝炎病毒基因组结构进行分析,设计肝炎病毒诊断分型芯片的寡核苷酸(O ligo)探针。方法:利用BLAST软件对乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、丙型肝炎病毒(HCV)6个亚型的DNA及cDNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;然后用生物信息学软件Array designer 3.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的O ligo探针。结果:获得156条60-m er探针,用于打印成DNA芯片,进行HBV、HDV的联合检测和HCV的基因分型。结论:利用BLAST检索系统和生物学软件Array desig-ner 3.0设计肝炎病毒诊断分型芯片的探针,是一种简便可行、有效的方法。

摘要：背景:慢性髓细胞性白血病是以造血干细胞的恶性克隆性增殖为特征。慢性期的慢性髓细胞性白血病患者如果不予以有效的治疗,必然演进为急变期,其预后往往非常差。因而,从全基因组水平上阐明慢性髓细胞性白血病的发生机制显得尤为重要,目的:应用AppliedBiosystems表达芯片系统对慢性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞的基因表达谱进行观察。设计:观察对比分析。单位:南方医科大学基因工程研究所。对象:两例骨髓样品(1例慢性髓细胞性白血病患者,1例健康者)来自于广州军区广州总医院血液科。方法:实验于2004-10/2005-09在南方医科大学基因工程研究所完成。分别从一例慢性髓细胞性白血病患者与一例健康人的骨髓样品中分离单个核细胞,提取总RNA,纯化mRNA。通过逆转录体外线性扩增的方法对mRNA样品进行标记,将标记好的cRNA样品与芯片杂交。利用ABI1700化学发光芯片分析仪对骨髓单个核细胞的基因表达谱差异情况进行分析。通过比较同一样品不同芯片间的数据信息,对芯片结果的可重复性进行评估。主要观察指标:①总RNA及标记后的cRNA质量的评定。②芯片可重复性验证。③芯片杂交结果。④半定量反转录-聚合酶链反应结果。结果:①利用统计学数据分析工具,通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达差异,总共发现了6706个差异基因。其中,与慢性髓细胞性白血病密切相关的差异基因为68个,上调的有17个,下调的有51个。②位于C/EBPalpha信号通路和CD40受体信号通路中的大部分差异表达基因,其表达水平降低。③通过对重复实验结果的相关性及检测一致性分析,证实了芯片结果的可重复性较好。而两组重复实验间的相关系数分别是,慢性髓细胞性白血病组为0.991,健康组为0.988。④半定量反转录-聚合酶链反应验证了芯片分析结果的可靠性。结论:通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达谱的差异,发现了大量的差异表达基因。这些数据将为寻找可用于慢性髓细胞性白血病患者疾病治疗的分子靶标提供有用的信息。