摘要：目的构建人T细胞活化核因子C2(NFATc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果研究成功构建了不同片段长度(2170、2077、1802、1651、1083、323 bp)的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍(1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850)。中浓度(5 mmol/L)和高浓度(10 mmol/L)的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍(1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321)。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍(1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321)。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降(2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786)。结论pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。

摘要：背景与目的:通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增免疫球蛋白重链(immunoglobulinheavychain,IgH)基因对其克隆性的检测,可以辅助诊断淋巴瘤。缺点是假阴性率较高,在石蜡包埋组织中尤为明显。本研究拟采用手工显微切割、免疫球蛋白重链和轻链(immunoglobulinlightchain,IgL)联合测定等方式,探讨该方法在石蜡包埋组织中非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin\slymphoma,NHL)诊断中的价值。方法:选用1对IgH引物、1对T细胞受体γ(Tcellreceptorγ,TCRγ)、TCRγ引物、2对新设计的轻链引物,通过PCR、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染技术,检测经形态学及免疫组织化学确诊的58例石蜡包埋组织标本,包括39例B细胞淋巴瘤、16例T细胞淋巴瘤和3例淋巴结反应性增生组织。以DG75和Jurkat淋巴瘤细胞系DNA作为对照。结果:IgH引物P1在39例B细胞淋巴瘤检出阳性率79.5%(31/39),假阳性率6.25%(1/16),IgL引物在B细胞淋巴瘤检出阳性率71.8%(28/39),假阳性率12.5%(2/16),经统计学分析二者检出率无显著性差异(P>0.05)。二者联合检测,B细胞淋巴瘤阳性检出率可以达到92.3%,假阳性率并无明显提高(12.5%)。以上重排引物在反应性增生淋巴结组织中均未检出。结论:IgH与IgL引物联合检测可明显提高石蜡包埋组织中B细胞淋巴瘤的检出率,并为B-NHL的诊断及鉴别诊断提供了有效的辅助手段。

摘要：目的探讨限制性输液复苏法对失血性休克孕兔血流动力学变化及血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）含量变化的影响。方法将20只妊娠中晚期新西兰大白兔分为2组，分别采用生理盐水传统输液复苏法（PNL组）及限制性输液复苏法（PLH组），每组10只。建立非控制性失血性休克模型，实验设计分为休克期（0～30min），院前复苏期（30～90min）及院内复苏期（90～180min）。休克期：两组孕兔均接受颈动脉放血至平均动脉压（MAP）为40～45mmHg（1mmHg=0．133kPa）。院前复苏期：剪开两组孕兔孕囊血管放血，复制活动性出血模型，然后PNL组和PLH组孕兔分别接受生理盐水及自身血复苏至MAP为80、60mmHg。院内复苏期：两组孕兔均接受手术止血及输血、输液治疗。比较两组孕兔各时间点血流动力学、TNF-α及IL-6含量的变化，记录输血、输液量及生存率。结果（1）120min时，PLH组孕兔呼吸、心率分别为（66±16）、（235±41）次，PNL组分别为（78±16）、（291±37）次，两组分别比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；PLH组孕兔MAP和中心静脉压（CVP）分别为（80．4±7．2）mmHg、（8．0±4．4）cmH2O，PNL组孕兔分别为（72．5±8．2）mmHg、（5．8±3．1）cmH2O，两组分别比较，差异也有统计学意义（P〈0．01）；（2）两组孕兔血清TNF-α、IL-6含量休克后均升高，且在240min时达高峰，PLH组孕兔血清TNF-α、IL-6含量分别为（105±67）、（118±51）ng／L，PNL组分别为（280±160）、（311±240）ng／L，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01），且PLH组孕兔血清TNF-α、IL-6含量在480min时已降至正常；（3）PLH组输血、输液量在院前复苏期分别为（16．0±2．2）、（39．0±5．5）ml，在院内复苏期分别为（28．0±6．7）、（90．0±7．1）ml，PNL组在院前复苏期分别为（31．0±8．2）、（85．0±7．9）ml，在院内复苏期分别为（37．5±9．4）、（140．0±24．8）ml，两组比较，差异也有统计学意义（P〈0．05）；（4）PLH组孕兔24、72h的生存率分别为100％、90％；PNL组为80％、60％，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论限制性输液有利于失血性休克孕兔血流动力学指标的恢复，缓解血清TNF-α、IL-6含量升高的程度，从而提高了动物生存率。

摘要：在研究细胞形状时,凹点是一个非常有意义的参数。本研究设计了一种简易的细胞凹点搜寻算法,该算法主要计算一次凸闭包,将凸闭包与原图相减后得出凹区,根据凹区与原图中心点的最短欧式距离来判断原图上的凹点。本算法将细胞轮廓上的凹点搜寻转换为凹区轮廓上的凸点搜寻,搜寻范围大大减少,实验结果证明算法可靠,运算速度快。

摘要：目的观察总结海水环境中感染创伤弧菌（vibrio vulnificus，Vv）后局部组织和器官的病理学特点，为临床Vv感染的诊治提供一定的实验依据。方法128只SPF级昆明小鼠，随机分成4组，每组32只，分别为海水Vv菌液浸泡组（A组）、等渗盐水Vv菌液浸泡组（B组）、单纯无菌海水浸泡组（c组）以及单纯无菌致伤组（D组）。每组又随机分成0，6，12，24h4个不同时间组，每组8只。D组小鼠仅无菌致伤，A、B、C组小鼠在无菌致伤后按分组设计均浸泡于相应液体中45～60min。于不同时段对各组局部肌组织及主要脏器组织进行取材、制片、HE染色和观察；采鼠尾血进行Vv的分离培养。结果A组创伤组织的损伤最为严重：0h时，可见肌纤维变性、溶解和断裂，但炎症反应不明显；12h时肌组织溶解坏死更加明显，肌间隙增宽，渗出及出血明显，并伴有大量中性粒细胞浸润；24h时，肌组织大片溶解坏死，微脓肿形成。总体来讲，Vv感染的A、B两组要比未感染的c、D两组病变严重，而组织修复过程也要缓慢。海水菌液浸泡组脱离浸泡后24h时仍无好转趋势，并且该组部分小鼠Vv血培养结果为阳性。Vv血培养阳性的小鼠其主要脏器也出现不同程度的损伤，以肺和肾脏的广泛出血性损伤为主。结论在海水环境中Vv经由皮肤伤口侵入后，其伤口往往表现为感染早、发展快且病变严重的特点。感染组织病理学特点为组织大片的溶解坏死和大量中性粒细胞浸润并伴有脓腔形成；Vv可经伤口人血，引发败血症，并导致小鼠肺、肾等多脏器的损伤。

摘要：目的制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针。方法设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达。结果成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号。结论本研究制备的反义cd99l2RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础。

摘要：目的构建针对FMNL2基因的shRNA表达载体，以用于后续的功能学实验，并观察其对SW620细胞增殖的影响。方法依据设计shRNA的原则，针对人FMNL2的mRNA序列，设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列，构建重组质粒PGenesil—FMNL21和PGenesil—FMNL22，并设阴性对照PGenesil—HK。转柒重组质粒至SW620中，转染48h后荧光显微镜下观察转柒率，应用荧光定量PCR法检测PGenesil—FMNT21和PGenesil-FMNL22的瞬时干扰效果；应用M1Tr法检测转染48h和72h后对SW620增殖活性的影响。结果酶切及测序证实重组质粒构建成功；转染48h荧光显微镜观察转染率：PGenesil，FMNL21为（60、8±2．8）％，PGenesil—FMNL22为（58．7±2．9）％，PGenesil，HK为（62．6±1．7）％，三者之间差异无统计学意义（P〉0．05）；PGenesil—FMNL21对FMNL2基因的抑制效率最高为77、1％；转染12、24、48、72、96h后PGenesil—FMNT21对FMNT2的抑制率分别为13．5％、57．3％、80．3％、62、4％、33、2％；MTlP检测在转染48h和72h后，实验组细胞的增殖活性小于对照组细胞的增殖活性（P〈0．05）。结论PGenesil—FMNL21和PGenesil—FMNL22均有沉默FMNL2基因的作用，其中PGenesil，FMNL21的沉默作用最大；FMNL2可能对促进细胞的增殖有一定的作用。

摘要：目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

摘要：背景:肌动蛋白和Tau蛋白分别是微丝和微管的重要组成成分,肌动蛋白和Tau蛋白的分布能否作为微丝和微管的观察指标。目的:构建肌动蛋白和Tau蛋白的红色和绿色荧光蛋白融合表达载体并转染真核细胞,观察其在细胞内的表达和定位情况。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2008-03/08在南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室共同完成。材料:克隆在pcDNA3载体上的肌动蛋白和Tau蛋白真核表达载体pcDNA3-actin和pcDNA3-Tau,以及红色荧光蛋白表达载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2、大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由南方医科大学病理生理学教研室保存。方法:将克隆在pcDNA3上的肌动蛋白和Tau蛋白亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,然后转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察重组载体的表达和细胞内定位。主要观察指标:NIH3T3细胞转染24h后,利用Leica荧光显微镜观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况。结果:重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在NIH3T3细胞中可获得高量表达。融合蛋白发出的红色和绿色荧光均表明,肌动蛋白在细胞质中呈短丝状弥散分布,Tau蛋白以细胞核为中心呈放射状排列。结论:成功构建了肌动蛋白和Tau蛋白的不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,这为研究细胞骨架在信号分子移位中的作用提供了一个重要的工具。

摘要：目的构建人细胞表面黏附分子P选择素(p-selectin)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参质粒p RL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p-selectin报告基因进行双荧光素酶的检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/p RL-SV40组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/p RL-SV40组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论 pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。