摘要：目的构建大鼠Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3(BNIP3)干扰质粒,研究其对BNIP3蛋白表达水平的影响。方法利用Invitrogen公司在线软件设计大鼠BNIP3(NM_053420)干扰片段,合成互补的单链寡核苷酸,蒋退火后形成的双链克隆入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体,连接产物转化感受态细胞,增菌,质粒小量提取并测序。将构建的干扰质粒与大鼠BNIP3表达质粒共转染到HEK293细胞中,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测对目的基因的干扰情况。结果构建的2个干扰质粒经测序证实序列正确,与BNIP3表达质粒共转染后显著抑制外源性BNIP3的mRNA和蛋白表达。结论成功构建了大鼠BNIP3干扰质粒,为进一步研究BNIP3的功能打下了基础。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限、可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血。目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能。设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意。方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养;取扩增第3或4代的人脐血间充质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸。主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达。结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45。培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白。结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞。

摘要：背景:有研究证实,骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能。目的:体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞,并检测其免疫学表型,观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化。设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。材料:骨髓来源于健康供者。方法:利用Percoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞。采用脂质体介导转染法,选生长良好的传代细胞,以血管内皮生长因子165基因转染人骨髓CD34+干细胞。主要观察指标:采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型。经血管内皮生长因子165基因转染后,人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况。结果:体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞,细胞形态呈成纤维细胞样。CD44、CD29和c-kit阳性,CD31和CD54阴性;经血管内皮生长因子165诱导后,人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44表达降低,CD31升高,呈现典型的内皮细胞表型,并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力。结论:采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离,可培养扩增出高度同源的CD34+干细胞,经血管内皮生长因子基因转染后,CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型,验证了其具有向内皮细胞分化的潜能。

摘要：目的构建小鼠L-型钙通道CaV1.2α_1亚基(α_(1C))C末端的原核重组载体并进行表达和鉴定。方法根据小鼠α_(1C)基因序列设计合成特异性引物,PCR扩增出其C末端(1808-2139)基因,插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-KG中,在大肠杆菌BL21中诱导GST融合蛋白的表达。结果构建的重组质粒经酶切后可见约1000 bp、5000 bp大小的片段,与预期结果一致,测序结果表明序列正确。在异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组菌表达出一个分子量约为70 ku的表达产物,Western blot结果证实重组GST融合蛋白可与针对α_(1C)亚基C末端的抗体发生特异性的反应。结论小鼠α_(1C)亚基的C末端编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-KG中,并在大肠杆菌BL21中获得表达,为进一步纯化和研究相互作用蛋白奠定了基础。