摘要：通过构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的小片段发夹状RNA(shRNA)干扰表达质粒,研究了shRNA表达质粒沉默GnT-Ⅴ基因后对LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响.设计了靶向GnT-Ⅴ基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染人结肠癌LoVo细胞,通过G418筛选建立稳定低表达GnT-Ⅴ基因的细胞株.分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测shRNA对GnT-Ⅴ基因mRNA及蛋白质表达的影响.并通过CCK-8增殖实验、异质黏附实验、划痕愈合实验、趋化运动实验、细胞侵袭实验评价pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA对人结肠癌LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响.实验成功地构建了GnT-Ⅴ shRNA表达质粒,并且该质粒明显下调GnT-Ⅴ的表达,LoVo GnT-Ⅴ/1564和LoVo GnT-Ⅴ/2224的mRNA水平的抑制率分别为82%和71.5%,蛋白质水平的抑制率分别为68%和56%.选择干扰效率较高的LoVo GnT-Ⅴ/1564进行进一步实验.CCK-8增殖实验显示,与阴性对照组相比,LoVo GnT-Ⅴ/1564的增殖受到明显抑制(P<0.001),尤以72h为著;下调GnT-Ⅴ表达可增强LoVo细胞的黏附能力(t=-3.357,P<0.01),而显著抑制LoVo细胞的趋化运动能力(t=44.051,P<0.001);划痕实验结果也显示抑制GnT-Ⅴ表达延长LoVo细胞的愈合时间;用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验结果显示,LoVo GnT-Ⅴ/1564和LoVo GnT-Ⅴ/NC的穿膜细胞数分别为(5.10±1.25)个和(39.55±2.16)个,GnT-Ⅴ/1564组较阴性对照组明显减少(t=61.626,P<0.001).结果表明,靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表达质粒可以显著降低GnT-Ⅴ的表达,从而抑制LoVo细胞的增殖、迁移和侵袭能力,因此,该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗结直肠癌的有效靶点.

摘要：目的构建人Snail基因慢病毒干扰载体及观察干扰前后对鼻咽癌5-8F细胞增殖和侵袭的影响。方法设计Snail基因特异性RNAi靶序列,克隆至经双酶切后的plVTHM线性化载体,测序鉴定正确后,用病毒上清感染鼻咽癌细胞5-8F,流式细胞仪分选获得稳定干扰Snail基因的细胞亚系。荧光定量PCR检测mRNA表达情况;MTT法和体外侵袭实验分别测定对细胞增殖和侵袭的影响。结果plVTHM-siSnail慢病毒干扰载体构建正确。荧光定量PCR结果表明分选后的细胞Snail mRNA水平表达显著降低。干扰后的细胞增殖减慢,穿透基膜的细胞数量减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论plVTHM-siSnail表达质粒可显著下调Snail基因在5-8F中的表达,在一定程度上抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。

摘要：目的设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用.方法cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全 EBV基因组探针,它们的长度被定在300～600 mer并且具有高度特异性.从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和 RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体.所有的探针被测序鉴定.结果除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRFl基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆.结论EBV cDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础.

摘要：目的鼻咽癌高发于中国南方,是一种恶性度较高的肿瘤,与EB病毒(EBV)关系非常密切。本研究利用前期已经设计和克隆好的EBV已知和预测的编码基因作为cDNA探针,构建EBV芯片,用于检测鼻咽癌组织中的EBV基因表达。方法85个EBV基因探针通过一对设计于T/A克隆载体多克隆两端的引物进行PCR扩增。产物纯化后,与8000个人基因打印到同一张玻片上,建立EBV与人基因的检测芯片,随后用于检测鼻咽癌组织与正常鼻咽组织之间的基因表达差异,观测检测效果,以确定是否可以临床应用。结果在人的基因表达谱中,我们成功检测了大量的人基因表达。而在EBV阵列中,我们虽然得到了一些EBV基因表达的信号,但这些信号都非常微弱,没有明显可见的荧光,其表达强度无法与人的基因表达信号强度相比。结论虽然我们成功地构建了EBV芯片,但由于可能受到基因芯片检测的敏感性以及EBV基因在鼻咽癌中表达量的限制,不能用于临床检测,需要进一步改进研究方法。

摘要：目的探讨Polo样激酶I（PLK1）基因对胶质瘤细胞增殖的影响和可能机制。方法根据PLKl基因特点，设计并用化学方法合成了5个小干扰核糖核酸分子（siRNA）（P1、P2、P3、P4和P51。以这5个siRNA转染人胶质瘤TJ905细胞后，分别采用荧光实时定量RT—PCR和Westernblot检测儿KJmRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和Westernblot方法检测癌细胞增殖和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白水平，用TRAP—ELISA方法检测胶质瘤细胞端粒酶活性。结果所设计的5个siRNA均能明显抑制胶质瘤TJ905细胞PLKImRNA水平，以P4效果最好。以P4转染处理胶质瘤细胞后与脂质体对照组比较，PLKI基因mRNA水平和蛋白水平明显下调．差异有统计学意义（P均=0．000）。MTT结果显示，与脂质体对照组比较P4siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制．且呈浓度依赖性（r=0．868，P=0．000）。Western blot结果显示，与脂质体对照组比较P4siRNA转染组PCNA蛋白水平明显下降，差异有统计学意义（F=181．36，P=0．000）。***结果显示，与脂质体对照组比较P4siRNA转染组胶质瘤细胞端粒酶活性明显受到抑制，且呈浓度和时间依赖性（p=0．000）。结论PLKI基因对胶质瘤细胞增殖具有重要的调控作用：以PLKI siRNA转染处理胶质瘤细胞，可明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖，其机制可能与抑制端粒酶活性有关。

摘要：目的研制人类免疫缺陷病毒(HIV)快速筛查的寡核苷酸芯片并初步应用于临床。方法以HIV2个基因型(包括9个亚型)的32株典型性代表株和HIV2特有的vpx序列的保守序列为靶序列,设计长寡核苷酸探针,并制备成Oligo芯片。样品经随机特异性引物PCR标记后与芯片杂交,PCR产物同时进行测序分析。结果1例HIV患者芯片杂交结果阳性,20名健康对照血清均为阴性。阳性标本的序列分析表明,芯片杂交结果符合测序的分型结果。结论此芯片可初步用于检测血清HIVRNA,并对HIV基因(亚)型进行分析。

摘要：目的研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(Tm)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果与结论获得22条60 mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。

摘要：目的运用RNAi技术,设计针对BCR-ABL基因融合位点的siRNAs,研究其干扰后细胞变化。方法针对BCR-ABL基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行MTT法、RT-PCR及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果转染组与对照组相比细胞增殖减少,BCR-ABLmRNA表达量降低,并有明显的细胞凋亡。结论运用RNAi技术,可以有效地抑制BCR-ABL的表达,诱导细胞凋亡,为白血病的分子机制研究和基因治疗奠定基础。

摘要：目的　优化长寡核苷酸芯片方阵的构建。方法　采用4种不同玻片表面,4种点样液溶解经设计高度特异性探针,制备长寡核苷酸芯片。样品经RD -梯度PCR扩增标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果　点样液3×SSC与丙烯酰胺聚合物表面(国产玻片)联合使用杂交效果最佳。结论　该研究优化了长寡核苷酸芯片微阵列的构建,为芯片的下游技术发展提供支持。

摘要：目的构建pSUPERIOR-A20可调控性载体,检测其在肝转移亚系中表达的可调控性。方法通过基因芯片筛选出鼻咽癌肝转移相关基因,结合文献调研获得头颈部癌转移标签基因,并通过荧光定量PCR检测发现A20可能在鼻咽癌肝转移过程中发挥了重要作用。在线设计A20特异性干扰片段,选择相应酶切位点后将其插入pSUPERIOR质粒中,应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性。将pSUPERIOR质粒和Tet-on质粒共转染肝转移亚系5-8F-H3,PCR检测A20的表达。结果Real-time PCR检测A20在肝转移亚系5-8F-H3中的表达显著上调,结果具有统计学意义(P=0.005)。且成功构建了pSUPERIOR-A20载体,与Tet-on质粒共转染5-8F-H3后经嘌呤霉素筛选克隆,经荧光定量PCR检测阳性克隆A20基因的表达显著下调。结论成功构建pSUPERIOR-A20载体,并可有效干扰鼻咽癌肝转移亚系5-8F-H3中A20基因的表达,为进一步研究A20在鼻咽癌肝转移中的作用奠定了良好的基础。