摘要：目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

摘要：目的 构建以富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白（ TACO）基因为靶点的短发夹状RNA（ shRNA）表达慢病毒载体,鉴定其下调TACO表达的效果,以及对巨噬细胞吞噬和杀伤胞内结核分枝杆菌（ ***）的影响及相关机制. 方法 设计3条靶向小鼠TACO基因的shRNA表达片段及1条随机序列对照片段,插入慢病毒表达载体pSicoR 后利用293 T细胞进行病毒包装. 采用包装成功的慢病毒颗粒感染RAW264 .7细胞,分别采用real-time RT-PCR和Western blot方法鉴定干扰效果. 选择沉默效果最佳的重组慢病毒感染RAW264.7细胞,48 h后再采用***对这些巨噬细胞进行感染,倍比稀释培养法进行细胞内荷菌量的检测,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞内***与溶酶体的共定位情况,cyto-ID细胞自噬检测试剂盒检测各组细胞的自噬水平,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平.结果 测序结果证实重组慢病毒表达载体均构建成功. 靶向TACO基因的3种重组慢病毒均可下调RAW264 .7细胞中TACO的表达,其中LV-pSRT1的效果最佳. LV-pSRT1感染组RAW264 .7细胞内的荷菌量在感染后0 h时即显著低于对照慢病毒（LV-pSRTc）感染组（5.50×104 vs 8.1×104, P〈0.05）. 以***感染后0 h时间点的细胞内荷菌量为基准,***感染后48 h和72 h时LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内*** 的存活率显著低于对照慢病毒感染组（48 h： 134.54% vs 213.58%, P〈0.05; 72 h：148.18%vs 262.96%, P〈0.05）. 与对照慢病毒感染组比较,LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内***与溶酶体的共定位率显著上调（75.67%vs 10.66%, P〈0.05）,同时细胞的自噬水平显著上调（16.20%vs 8.50%, P〈0.05）,LC3Ⅱ的相对表达水平也显著提高（0.51 vs 0.34, P〈0.05）. 结论 TACO基因特异性RNAi慢病毒表达载体可有效抑制RAW264.7细胞中TACO的表达,抑制巨噬细胞对***的吞噬能力,增强巨噬细胞对胞内***的清除能力. 下调TACO表达对巨噬细胞杀伤胞内***影响的机制与其通过自噬溶酶体途径提高***吞噬体与溶酶体的融合有关.

摘要：目的构建一种新型10-23脱氧核酶（DZ）真核表达载体，并鉴定其在细胞内表达10—23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果。方法设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN—PSL，其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶（MLV—RT）的引物结合序列、1个多克隆酶切位点（MCS）及1个逆转录终止信号序列。将ODN—PSL插入框架质粒pBUDCE4．1中启动子PCMV的下游，获取重组质粒pBUD—PSL。将MLV—RT的编码基因克隆至pBUD—PSL中另一启动子PEF-1a的下游，构建重组质粒pSDE01。将pSDE01转染入鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞，采用RT—PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性。通过计算机软件模拟巨噬细胞TACOmRNA的二级结构，以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10—23DZ——DZ1，将DZ1表达序列插入pSDE01中ODN—PSL的MCS中，获取重组表达载体pSDE01-DZ1。将pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞，并设未转染对照组。转染后48h，采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达；并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达，各组实验均独立重复3次。结果限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功，将其转染入RAW264．7细胞后检测到MLV-RT的表达，而且表达产物具有逆转录酶活性。pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞后48h，PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达；半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示，与未转染组相比，pSDE01-DZ1转染后48h巨噬细胞TACOmRNA表达水平下降了77．7％（0．193±0．008比0．864±0．005，P〈0．05），TACO蛋白表达量下降了73．3％（0．114±0．051比0．427±0．043，P〈0．05）。结论成功构建了一种操作简便的新型10—23DZ表达载体，所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达，并抑制相应靶基因的表达。

摘要：目的观察小鼠RAW264.7巨噬细胞不同极化状态下lincRNA-cox2表达变化，初步探讨lincRNA-cox2对巨噬细胞极化的影响。方法以IFN-γ/LPS刺激小鼠RAW264.7细胞诱导M1型极化，IL-4刺激RAW264.7细胞诱导M2型极化，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组细胞lincRNA-cox2的表达。设计并合成针对lincRNA-cox2基因的siRNA及无关序列，脂质体转染RAW264.7细胞，48 h后分别加入IFN-γ/LPS或IL-4继续诱导M1/M2型巨噬细胞，采用酶联免疫试验（ELISA）检测细胞因子IL-12及IL-10的分泌量；RT-PCR检测与巨噬细胞极化相关的iNOS、TNF-α、Arg-1、Fizz1的表达。将lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞，检测其对M1极化表型的影响。结果RT-PCR结果显示，M1型巨噬细胞的lincRNA-cox2表达水平显著高于未极化细胞和M2型巨噬细胞。与对照组相比，lincRNA-cox2-siRNA转染RAW264.7细胞后，经IFN-γ/LPS诱导的M1型巨噬细胞中IL-12分泌降低，iNOS和TNF-α表达下降；而经IL-4诱导的巨噬细胞中IL-10产生增加，Arg-1和Fizz1表达升高。lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞后，IL-12分泌降低，IL-10产生增加，其特点向M2样巨噬细胞转换。结论lincRNA-cox2参与调控小鼠巨噬细胞的极化，促进M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化。

摘要：目的 建立聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）联合等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测bcr/abl融合基因T315I点突变的方法,以提高bcr/abl基因T315I突变检出率.方法 方法学建立.构建abl基因野生型和T315I突变型重组质粒作为检测对象,设计一对野生型和突变型abl基因序列的通用引物,分别以野生型和T315I突变型质粒作为模板,PCR扩增出目的片段,经酶切初筛检测abl基因T315I突变情况,另设计一对仅针对T315I突变的特异性引物进行AS-PCR检测.并对具有该基因突变的1例慢性粒细胞白血病患者进行检测,同时对该方法的灵敏度和特异性进行检测.结果 PCR扩增的目的片段（273 bp）经限制性内切酶Dde Ⅰ酶切后,野生型abl基因片段产生141、68、46和18 bp4条片段,而T315I突变型abl基因片段酶切后产生159、68和46 bp3条片段.PCR-RFLP方法可以检测T315I突变,检测灵敏度为6％.再以酶切产物作为模板进行AS-PCR,优化反应条件,AS-PCR所能检测到的T315I最低突变浓度为0.18％.所测临床标本结果显示,该患者发生了bcr/abl融合基因T315I突变.结论 PCR-RFLP联合AS-PCR检测方法特异性好、灵敏度高,能够给临床检测abl基因T315I突变提供一种新型的检测方法.

摘要：目的分析口腔鳞状细胞癌oralsquamouscellcarcinoma，OSCC）组织特征长链非编码RNA（***，lncRNA）表达谱，并探讨lncRNA结肠癌相关转录子2（coloncancerassociatedtranscript2，CCAT2）在OSCC中的表达及临床意义。方法采用高通量lncRNA芯片检测3例OSCC患者的癌组织及癌旁正常组织lncRNA表达水平，分析OSCC组织特征性lncRNA表达谱，进一步通过实时定量PCR（***，RT-qPCR）检测86例OSCC及对应的癌旁组织中CCAT2的表达，并分析其与临床病理特征关系。设计合成CCAT2的靶向小干扰RNA（CCAT2-siRNA），脂质体转染舌鳞状细胞癌Tea8113细胞。实验分为阴性对照组和CCAT2-siRNA转染组（实验组），利用CCK-8实验检测CCAT2干预对Tca8113细胞增殖能力的影响。结果OSCC患者癌组织与癌旁对照样本间差异表达的lncRNA共1685个，其中936个表达上调，749个表达下调，差异表达倍数≥10的lncRNA共23个。RT—qPCR验证结果显示，与癌旁组织相比，IncRNACCAT2在OSCC组织中高表达（平均上调5．7倍；P〈0．01）。临床病理相关分析显示，CCAT2表达水平还与OSCC的细胞分化程度及病理分期相关。低分化OSCC组织中CCAT2表达水平明显高于中、高分化OSCC组织（P=0．015）；TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期OSCC组织的CCAT2表达水平明显高于Ⅰ＋Ⅱ期标本（P=0．022）。CCK-8实验结果显示，下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞CCAT2表达可明显抑制细胞增殖，转染48、72h实验组A值较对照组显著降低（P〈O．01）。结论多种IncRNA在OSCC患者肿瘤组织中呈异常表达，其中CCAT2在OSCC中的表达上调可能与OSCC的发生发展有关。

摘要：目的利用bcl-x微基因(minigene)构建重要顺式作用元件B2G、CRCE2的突变微基因,建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法以构建成功的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR的方法,按碱基互补配对原则设计能让顺式元件B2G,CRCE2定点突变的引物,进行PCR反应。PCR反应结束后,用DpnⅠ对模板质粒DNA进行消化,然后使PCR产物发生自身环化反应。将环化产物转化入感受态DH5α,通过筛选并最后利用测序来鉴定所构建突变微基因成功与否。结果测序结果鉴定,所克隆的突变微基因序列碱基无一错误突变。并且在HL-60细胞中,RT-PCR实验表明bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响,pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xS几乎消失,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xL/bcl-xS为1.6。结论成功构建及应用人类凋亡相关基因bcl-x的突变微基因,顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失,CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。

摘要：目的评价牙周炎患者进行口腔超声洁治时使用不同含漱液对空气中菌落数的影响。方法分别选取轻、中、重度慢性牙周炎患者各54例,再随机将同种程度的牙周炎患者各分成3组,每组18例。洁治前分别给轻、中、重度牙周炎的各组患者用金银花液(含漱液A)、3%双氧水(含漱液B)、生理盐水(含漱液C)进行含漱。对超声洁治开始0、30 min及结束后10、20 min的空气样本进行细菌培养和菌种鉴定。结果三因素析因设计资料的方差分析结果显示:牙周炎程度、含漱液种类及采样时段三个因素存在交互作用(F=2.666,P=0.002)。空气菌落数比较:洁治开始时,轻、中、重度各组患者中使用不同含漱液时空气菌落数比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。洁治开始30 min,使用相同漱口液患者中均为轻度牙周炎患者的空气菌落数最低,重度患者最高,各组患者使用含漱液A、B时的空气菌落数较使用含漱液C低。各采样点比较,患者头部右侧采样点菌落数最高,差异均有统计学意义(均P0.05)。空气中检出菌种主要为草绿色链球菌(32.53%)、凝固酶阴性葡萄球菌(24.56%)、丝状真菌(18.48%)等。结论口腔超声洁治时空气中存在多种条件致病菌,菌落数与牙周炎程度呈正相关。使用金银花液含漱对降低洁治中、后的空气菌落数有良好效果。

摘要：本研究旨在建立一种简单、灵敏的,能检测多种NPM1突变体的方法,以降低NPM1突变的漏检率。通过构建NPM1基因野生型和最常见的突变型A、B、C、D重组质粒作为检测对象,根据NPM1不同突变体碱基排列方式不同,设计1对特异性引物,使得上游引物3'末端的碱基与突变体A、B、C、D匹配,而与野生型NPM1不匹配;通过条件优化,建立检测多种NPM1突变的ARMS-PCR的方法。通过对该方法的检测范围、灵敏度的评估及与直接测序法的比较,判断该方法的可行性。结果表明,成功构建NPM1基因野生型和突变型A、B、C、D 5种重组质粒,经测序鉴定和目的片段一致。ARMS-PCR方法可以检测到ABCD 4种突变体,检测范围在103copies/ml-109copies/ml,其灵敏度为0.01%,而当突变体含量低于10%时采用直接测序则检测不出突变。结论:本研究建立了一种可以检测NPM1 4种高频突变的ARMS-PCR方法。该方法灵敏度高,可以检出95%以上的突变,为临床检测NPM1基因突变提供一种新型的检测方法。

摘要：目的 探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中环状RNA circHIPK3的表达及临床意义,并探索circHIPK3调控微RNA124表达对OSCC细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量PCR检测90例2016年1月至2017年5月于南昌大学第二附属医院的OSCC患者癌组织、配对的癌旁组织及OSCC细胞株CAL27、SCC15和人正常口腔角质细胞株hNOK中circHIPK3的表达水平并分析其与患者临床病理特征关系.设计合成circHIPK3的靶向小干扰RNA si-circHIPK3和阴性对照序列si-NC,分别转染CAL27和SCC15细胞,细胞计数（cell counting kit-8,CCK-8）检测circHIPK3对CAL27和SCC15细胞增殖能力的影响.实时荧光定量PCR检测微RNA 124在OSCC中的表达,分析circHIPK3的表达与微RNA124表达的相关性.CAL27和SCC15细胞分别转染si-circHIPK3和si-NC,实时荧光定量PCR检测细胞中微RNA124表达变化.CAL27和SCC15细胞分别转染si-NC、si-circHIPK3、微RNA 124模拟物、si-circHIPK3±微RNA124抑制物,CCK-8法检测OSCC细胞增殖的变化.结果 OSCC组织中circHIPK3表达水平[2.23（1.86,3.00）]显著高于癌旁正常组织[1.05（0.85,1.26）,U=1 094,P=0.000]. CAL27（3.02±0.51,P=0.000）和SCC15细胞（3.16±0.75,P=0.000）中circHIPK3表达水平均显著高于hNOK细胞（1.26±0.30）.circHIPK3在不同临床分期及不同细胞分化程度患者癌组织中表达差异均有统计学意义（P＜0.05）.抑制circHIPK3表达后,CAL27和SCC15细胞增殖能力受到明显抑制,差异均有统计学意义（P＜0.05）.OSCC组织中微RNA 124表达水平（0.61±0.35）较癌旁正常组织显著下调（1.13±0.39,t=-5.36,P＜0.05）.相关性分析显示OSCC组织中circHIPK3的表达与微RNA124呈显著负相关（r=-0.767,P＜0.001）.与沉默circHIPK3相比,在沉默circHIPK3的CAL27和SCC15细胞中加入微RNA 124抑制物共转染之后,沉默circHIPK3抑制细胞增殖的能力部分逆转.结论 OSCC中circHIPK3的表达水平上调,下调circHIPK3的表达水平可抑制OSCC细胞的增殖,circHIPK3可能通过调控微RNA124表达参与OSCC的发生和发展过程.