摘要：目的:探讨唯BH3域蛋白Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)在缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法:在体外原代培养出生1～3 d的大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组:(1)正常对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+bim-siRNA组。倒置显微镜下观察心肌细胞的搏动频率和节律。全自动生化分析术检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,用MTT法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Western blotting检测细胞Bim、Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表达。结果:免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。bim-siRNA转染均能有效沉默bim基因的表达(P<0.01),其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧使心肌细胞的搏动频率显著减慢,节律不规则,而沉默bim基因的表达能使细胞搏动频率增加。缺氧损伤导致细胞培养液中LDH含量较空白对照组明显增加(P<0.01),心肌细胞存活率明显下降(P<0.05),细胞凋亡率较空白对照组明显增加(P<0.01),转染bim-siRNA后细胞培养液中LDH含量显著减少,细胞存活率升高,细胞凋亡率下降。缺氧损伤导致心肌细胞Bax和p-p38 MAPK表达升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),bim-siRNA的转染能够抑制缺氧导致的上述改变(P<0.01或P<0.05),并且与心肌细胞凋亡发生率降低一致,p38 MAPK表达无明显变化。结论:沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制Bax、p-p38 MAPK的表达和增强Bcl-2蛋白表达有关,这有望为冠心病的治疗提供新方向。

摘要：目的构建干扰表皮生长因子受体(EGFR)的pSilencerTM-EGFR表达质粒,转染入非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株,为观察对EGFR的沉默效应奠定基础。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以pSilencerTM2.1-U6-hygro质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5α大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体2000分别转染人类非小细胞肺癌细胞株A549,用潮霉素(Hygromycin B)筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4种重组干扰质粒,分别命名为pSilencerTM-EGFRⅠ、pSi-lencerTM-EGFRⅡ、pSilencerTM-EGFRⅢ和pSilencerTM-EGFRⅣ;②成功转染A549细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入A549细胞。

摘要：目的探讨可溶性重组脂联素球状结构域融合蛋白(GST-gAD)在大肠杆菌中的优化表达及其抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的生物学活性。方法用含有GST-gAD基因的原核表达载体pGEX-KG-gAD转化*** J M109,同理空载质粒pGEX-KG作为内对照同时转化*** J M109;将影响融合蛋白表达的4个因素,温度、IPTG浓度、细菌密度OD600和诱导时间进行正交设计,确定其优化表达条件,用亲和层析法纯化GST-gAD;用MTT法检测GST-gAD对MDA-MB-231增殖的影响。结果GST-gAD最佳表达条件为温度32℃,IPTG的浓度1.0mmol/L,诱导前细菌密度OD6001.0,诱导表达时间1.5h。GST-gAD浓度高于0.5μmol/L时对MDA-MB-231细胞的生长具有明显的抑制作用。结论通过正交设计确定了可溶性GST-gAD融合蛋白在大肠杆菌中表达的优化条件并且当重组融合蛋白在大于0.5μmol/L时对MDA-MB-231细胞的生长具有明显的抑制作用。