摘要：目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的人血管内皮细胞生长因子121的真核质粒,检测所制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮细胞生长因子的水平。方法:设计携带酶切位点的扩增引物,通过PCR技术扩增人血管内皮细胞生长因子121编码基因全序列,以粘端连接克隆法将其编码片段定向连接入质粒载体pEGFP-N2的多克隆位点中,构建pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒,采用酶切法、PCR以及DNA序列测定法鉴定所构建的重组质粒。全骨髓差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增传代,通过形态学观察及表面标记物进行细胞鉴定。通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。将制备好的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在体外缺氧环境下分别培养6,12,24h,另设相同缺氧干预下的空白骨髓间充质干细胞组,以转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组作为对照,采用RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达量。结果:酶切鉴定法、PCR鉴定法、DNA序列测定皆证实pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功。使用pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜检测提示hVEGF121/EGFP蛋白在骨髓间充质干细胞中存在表达。在体外模拟心肌缺氧的环境下分别培养6,12,24h后,RT-PCR检测示转染重组质粒的骨髓间充质干细胞组各时间段缺氧后的血管内皮生长因子mRNA表达量均高于对照组(P0.05);空白骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达量随缺氧时程的延长而增加。结论:①成功构建携带人VEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,并在骨髓间充质干细胞中获得表达。②证实表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在24h以内的不同时长缺氧下,维持较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的血管内皮生长因子表达。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血/梗死区域后,面临缺氧缺血微环境,其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用,是目前存在争论的焦点之一。目的:探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/11在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成。材料:清洁级新西兰大白兔2只,由南昌大学医学院实验动物中心提供。方法:常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞。细胞缺氧微环境在Anaero Pack密闭方盒中产生,盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2,产生CO2),指示条监测氧的耗竭,根据缺氧培养时程分为缺氧0,6,12,24h组。主要观察指标:RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。结果:血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0h组<6h组<12h组<24h组(P<0.01)。结论:缺氧24h以内的培养环境下,骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加。

摘要：目的 探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中环状RNA circHIPK3的表达及临床意义,并探索circHIPK3调控微RNA124表达对OSCC细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量PCR检测90例2016年1月至2017年5月于南昌大学第二附属医院的OSCC患者癌组织、配对的癌旁组织及OSCC细胞株CAL27、SCC15和人正常口腔角质细胞株hNOK中circHIPK3的表达水平并分析其与患者临床病理特征关系.设计合成circHIPK3的靶向小干扰RNA si-circHIPK3和阴性对照序列si-NC,分别转染CAL27和SCC15细胞,细胞计数（cell counting kit-8,CCK-8）检测circHIPK3对CAL27和SCC15细胞增殖能力的影响.实时荧光定量PCR检测微RNA 124在OSCC中的表达,分析circHIPK3的表达与微RNA124表达的相关性.CAL27和SCC15细胞分别转染si-circHIPK3和si-NC,实时荧光定量PCR检测细胞中微RNA124表达变化.CAL27和SCC15细胞分别转染si-NC、si-circHIPK3、微RNA 124模拟物、si-circHIPK3±微RNA124抑制物,CCK-8法检测OSCC细胞增殖的变化.结果 OSCC组织中circHIPK3表达水平[2.23（1.86,3.00）]显著高于癌旁正常组织[1.05（0.85,1.26）,U=1 094,P=0.000]. CAL27（3.02±0.51,P=0.000）和SCC15细胞（3.16±0.75,P=0.000）中circHIPK3表达水平均显著高于hNOK细胞（1.26±0.30）.circHIPK3在不同临床分期及不同细胞分化程度患者癌组织中表达差异均有统计学意义（P＜0.05）.抑制circHIPK3表达后,CAL27和SCC15细胞增殖能力受到明显抑制,差异均有统计学意义（P＜0.05）.OSCC组织中微RNA 124表达水平（0.61±0.35）较癌旁正常组织显著下调（1.13±0.39,t=-5.36,P＜0.05）.相关性分析显示OSCC组织中circHIPK3的表达与微RNA124呈显著负相关（r=-0.767,P＜0.001）.与沉默circHIPK3相比,在沉默circHIPK3的CAL27和SCC15细胞中加入微RNA 124抑制物共转染之后,沉默circHIPK3抑制细胞增殖的能力部分逆转.结论 OSCC中circHIPK3的表达水平上调,下调circHIPK3的表达水平可抑制OSCC细胞的增殖,circHIPK3可能通过调控微RNA124表达参与OSCC的发生和发展过程.

摘要：目的：运用TaqMan探针法对NRG3基因rs17101655 T→G单核苷酸多态性进行基因分型，探讨rs17101655 T→G单核苷酸多态性与原发免疫性血小板减少症(ITP)的关联性，为该病的发病机制提供重要线索。方法针对NRG3基因rs17101655位点T→G多态性，设计1对PCR引物和TaqMan探针，通过实时荧光PCR扩增进行基因分型；采用病例-对照研究，对中国汉族江西地区200例ITP和200例健康对照人群进行基因分型，比较两组人群基因型分布及频率差异。结果Rs17101655位点T→G多态性的基因型和等位基因频率分布在ITP病例组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TaqMan探针法可快速、高效地对单核苷酸多态性进行基因分型，本研究结果显示NRG3基因rs17101655位点不作为中国汉族人群ITP的易感位点。

摘要：目的根据细菌16SrRNA基因特点设计常见病原菌的特异性探针,采用酶显色技术构建基因芯片,探讨其临床应用的可能性。方法选取肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌等8种细菌性肺炎常见的病原菌的标准菌株作为研究对象,并选择12份患者的痰液标本进行检测。在16SrRNA基因保守区设计PCR反应的通用引物及革兰阳性菌、革兰阴性菌的通用探针,利用可变区的差异设计合成特异性探针,构建基因芯片。利用细菌16S rRNA基因设计的PCR通用引物进行扩增,所有8种细菌均获得350bp的扩增产物。以地高辛标记特异性探针,构建完成可用于8种常见病原菌检测的基因芯片,结果 8种标准菌株基因芯片检测均取得了预期效果,对12份痰标本中常规培养阳性7份,其对应芯片检测结果均成阳性,5份常规培养阴性的标本中,芯片结果提示阳性的有3份,其中1份为嗜肺军团菌,2份为使用抗生素后的患者标本。结论设计合成的PCR通用引物对扩增细菌的16SrRNA基因具有较高的特异性及灵敏度。构建的基因芯片可用于常见细菌性肺炎病原菌的检测鉴定,且对抗生素使用后的临床标本及苛养菌有一定的诊断价值。本研究所获得基因芯片对于细菌性肺炎的检测具有简单、快速、特异性及敏感性高的特点。

摘要：设计性实验是学生根据特定目的和要求,运用所掌握的理论知识和实验技能,对实验的材料、手段、方法、步骤等进行设计和准备,并最后完成正式实验.通过设计性实验,可以培养学生全面运用知识的能力、动手操作的能力、独立解决及处理问题的能力.探讨在临床血液学检验课程教学中开展设计性实验,并对其在实验教学中的效果进行评价。