摘要：目的观察足叶苦素（PPP）抑制胰岛素样生长因子I受体（IGF-IR）后对肝癌细胞增殖和运动的影响。方法体外培养肝细胞L02和肝癌细胞（Bel-7404、Bei-7402、HepG2和Huh_7），以Westemblot分析IGF-IR表达，以磺酰罗丹明B法分析细胞活性；在PPP抑制IGF-IR后，以流式细胞术分析细胞周期，以ArmexinV-FITC法分析细胞凋亡；在z-VAD-FMK抑制caspases后，以均质发光法检测caspase-3／7活性；划痕试验分析细胞运动能力。对数据进行析因设计方差分析，采用t检验或one-wayANOVA法进行组间比较。结果肝细胞L02中几乎检测不到IGF-IR，各肝癌细胞中IGF-IR呈不同程度表达。PPP抑制肝癌细胞增殖呈时间和剂量依赖性，经1．0μmol／LPPP处理HepG2细胞24h，G1、S期和G2／M期细胞比例分别为2．1％±0．4％、11．0％±0．7％和87．1％±0．6％，且划痕不愈合Icaspase-3／7活陛显著增加（t=11．83，P〈0．01）；HepG2细胞凋亡率为16．4％±0．4％，明显高于对照组的5．8％±0．2％（f=14．05，P〈0．01）；z-VAD-FMK抑制casgases表达，HepG2细胞凋亡率为11．3％±0．7％，明显高于对照组的5．8％±0．2％（f=11．83，P〈0．01）。结论IGF-IR表达与肝癌细胞增殖、运动和凋亡相关，可能是肝癌分子靶向治疗的有效靶点。

摘要：目的高迁移率超蛋白家族与肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展有关,本研究旨在探讨新标志物高迁移率超蛋白家族成员B3(high mobility group Box 3,HMGB3)对肝癌患者预后的临床预测价值。方法以自身配对法收集2015-08-06-2017-05-23南通大学附属医院行手术治疗肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织50例,以免疫组化法分析HMGB3蛋白表达,结合癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)及基因表达数据库相关信息,分析HMGB3基因转录对肝癌患者预后的影响;设计、筛选和验证HMGB3特异shRNA,转染肝癌HCCLM3细胞株,以四甲基偶氮唑盐比色法、克隆形成实验、划痕和Transwell实验分析癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭等,分析HMGB3与HCC生物学特性的关系。结果肝癌HMGB3阳性率(72.0%)高于癌旁组织(28.0%),χ2=19.360,P<0.001。TCGA数据库信息显示,372例肝癌组织HMGB3mRNA高于50例正常肝组织,t=5.041,P<0.001;HMGB3高表达患者中位生存期(47.4个月)低于低表达患者(100.6个月),P=0.031;HMGB3高表达的早期肝癌患者中位生存期(71.0个月)低于低表达患者(108.6个月),P=0.033;接受索拉菲尼治疗的HMGB3高表达肝癌患者中位生存期(22.0个月)低于低表达患者(52.0个月),P<0.001;以有效的shRNA-1干扰质粒转染HCCLM3细胞后,癌细胞增殖、克隆形成(t=5.056,P<0.001)、迁移(t=7.4,P<0.001)和侵袭(t=12.2,P<0.001)等生物学行为受抑制,差异均有统计学意义。结论 HMGB3异常表达与肝癌增殖、迁移、浸润和预后密切相关,是肝癌预后判别且具有应用前景的潜在标志物。

摘要：皮层蛋白(cortactin)是一种癌基因蛋白,是酪氨酸磷酸化激酶Src的作用底物,到目前为止,皮层蛋白受磷酸化调控的机制还不清楚。本研究用荧光共振能量转移(FRET)分析皮层蛋白受磷酸化调控后的蛋白质结构变化,推测皮层蛋白受磷酸化调控的可能机制。采用蓝绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)作为配对,设计和构建基于皮层蛋白羧基端SH3功能的蛋白质传感器,转染NIH/3T3细胞,将细胞以过钒酸盐(PV)和PP2处理,人为诱导或抑制细胞蛋白磷酸化,比较皮层蛋白的磷酸化和非磷酸化状态FRET的不同;进一步观察皮层蛋白磷酸化位点突变后FRET的变化,以此判断皮层蛋白的磷酸化作用后结构的变化。所设计的生物传感器供体和受体工作良好。FRET分析显示,在PP2处理后,FRET能量变化明显较对照组增高,但用PV处理后,FRET下降。皮层蛋白的磷酸化位点突变后,产生的FRET明显较野生型皮层蛋白产生的FRET为弱。因此推测,皮层蛋白在磷酸化后其分子结构处于"展开"状态,并可能以此增强和其他细胞蛋白的相互作用。

摘要：目的:观察干扰胰岛素样生长因子-Ⅰ型受体(insulin-like growth factor-Ⅰreceptor,IGF-ⅠR)表达对肝癌(PLC/PRF/5及Bel-7404)细胞增殖、周期、凋亡的影响及联合抗癌、靶向药物抑制细胞增殖的协同作用.方法:设计与合成多条针对IGF-ⅠR序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染肝癌细胞株、筛选高效质粒,观察沉默IGF-ⅠR表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制.结果:4对构建IGF-ⅠR-shRNA经筛选以s h R N A 4干扰效果最佳且具特异性;以shRNA4转染效率PLC/PRF/5细胞为71%和Bel-7404细胞为90%;在mRNA水平上抑制率前者为59.6%±2.8%,后者为54.9%±2.6%;蛋白水平上IGF-ⅠR表达均同步减少;转染72h后,PLC/PRF/5细胞增殖抑制率为63.87%±3.90%(t=19.244,P<0.001)及Bel-7404细胞为61.47%±1.70%(t=5.493,P<0.005),均呈时间依赖性,且增殖周期发生G1期阻滞,细胞周期蛋白(CyclinD1)表达受抑,细胞凋亡增加;shRNA4增加肝癌细胞对靶向药物索拉非尼及化疗药物奥沙利铂的敏感性.结论:下调IGF-ⅠR基因转录可抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡,改善肝癌细胞对靶向药物及化疗药物敏感性,提示IGF-ⅠR有望成为肝癌基因治疗的有效靶点.

摘要：目的:研究miRNA干扰质粒对胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)在肝细胞癌表达的抑制作用,探讨IGF-Ⅱ在肝细胞癌治疗中的价值.方法:以人IGF-Ⅱ基因序列设计并合成4条miRNA,将miRNA插入质粒构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP miR1-4干扰载体;筛选、转染HepG2细胞,以荧光定量PCR分析靶向肝癌IGF-Ⅱ基因表达的干扰效果;以ELISA法比较转染前后IGF-Ⅱ蛋白表达水平.结果:测序证实,成功构建了真核IGF-Ⅱ干扰质粒MR-IGF-Ⅱ-1-4,将干扰质粒转染至HepG2细胞,镜下显示转染效率50%;经荧光定量PCR扩增,沉默IGF-Ⅱ基因表达效率MR-IGF-Ⅱ-1为33%、MR-IGF-Ⅱ-2为43%、MR-IGF-Ⅱ-3为0%、MR-IGF-Ⅱ-4为3%.将其中MR-IGF-Ⅱ-2转染至HepG2细胞,在转录和蛋白水平上对IGF-Ⅱ具有较高干扰效率,分别达43.0%和43.5%.结论:成功构建了人miRNA干扰质粒,他能有效抑制HepG2细胞IGF-Ⅱ的表达.

摘要：目的：研究沉默磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3，GPC-3）基因转录抑制肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤生长与机制。方法：以人GPC-3基因序列设计并合成miRNA，构建GPC-3-miRNA干扰质粒。将其导入HepG2细胞，通过杀稻瘟菌素筛选出稳定株，移植裸鼠皮下成瘤。根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线，免疫组化法检测瘤组织内GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1表达。结果：肝癌HepG2、Hep3B 和 MHCC-97H 细胞 GPC-3表达较强（50%～80%）， SMMC-7721和Bel-7402细胞中等（18%～25%），PLC/PRF/5和Bel-7404细胞较弱（8%～10%）。以特异miRNA干预GPC-3基因转录，明显抑制 HepG2细胞增殖，呈时间依赖性；沉默 GPC-3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长，且瘤组织β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1等关键信号分子表达降低。结论：沉默GPC-3影响Wnt/β-catenin通路关键信号分子表达可能是抑制HepG2增殖的分子机制。

摘要：目的:探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单抗及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/p65siRNA干预NF-κB活化对肝癌HepG2细胞增殖和细胞膜糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达的影响。方法:体外培养人HepG2细胞并给予抗人TNF-α单克隆抗体,以流式细胞术检测细胞凋亡的情况;设计并合成针对NF-κB/p65 siRNA的质粒,在转录水平干扰NF-κB活化,以Western Blot检测P-gp表达。结果:单抗作用后,肝癌细胞凋亡的比率明显增加(P<0.01),用药后细胞株NF-κB表达水平明显降低(P<0.01),与培养液中明显降低的TNF-α水平呈显著正相关(r=0.89,P<0.01);NF-κB/p65 siRNA干预后可下调化疗药物引起的癌细胞NF-κB和P-gp的过表达。结论:以TNF-α单体干预肝癌细胞中NF-κB活化,可使细胞凋亡增加,siRNA可通过特异性抑制NF-κB/p65编码的mRNA,下调P-gp水平,促进肝癌细胞凋亡。

摘要：目的:用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达的ITGA2B c.2659C>T (p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型,并对其血小板膜表面糖蛋白αIIbβ3的功能做进一步研究。方法:根据ITGA2B基因信息设计并合成针对c.2659C位置的供体寡核苷酸和g RNA载体并进行体外转录。将g RNA和Cas9 m RNA与供体寡核苷酸共注射到受精卵,并送回到代孕鼠输卵管中。鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析,获得阳性F0鼠。阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代,获得经PCR和测序验证的F1代杂合型点突变GT小鼠,而后F1代小鼠通过彼此交配得到纯合型点突变GT小鼠以及对照组WT小鼠。通过检测小鼠鼠尾出血时间和隐静脉出血时间、血小板聚集功能、血小板表面αIIbβ3的表达和功能,对该小鼠模型的表型进一步验证。结果:小鼠鼠尾出血实验表明,GT小鼠割尾后的出血时间较WT小鼠明显延长(PT (p.Q887X)无义突变的GT小鼠模型。该小鼠模型血小板聚集功能缺陷,符合血小板无力症的表现。

摘要：目的观察磷脂酰肌醇蛋白多糖(GPC)-3基因特异性短发夹型RNA(shRNA)对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法设计、合成和筛选GPC-3特异的高抑制率shRNA并构建质粒;观察shRNA沉默GPC-3基因对肝癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建了4种GPC-3 shRNA干扰质粒,以脂质体介导分别转染HepG2细胞后,筛选出的shRNA干扰质粒抑制率最高达89.3%;以该高效GPC-3 shRNA质粒转染HepG2细胞24h、48h和72h后,细胞增殖较对照组分别下降了33.2%、56.0%和71.1%(P<0.05),细胞多被阻滞在G1期;HepG2细胞凋亡率达65.6%,显著高于对照组(约为5%,P<0.05)。结论 GPC-3特异性的shRNA可有效降低HepG2细胞中GPC-3基因转录水平,抑制增殖并促进其凋亡。因此,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。