摘要：目的分析胃癌发生各阶段组织中增殖诱导配体(APRIL)及其受体mRNA的表达水平.方法在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA的准确含量,并以靶基因和内参β2微球蛋白(β2M)mRNA含量比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测靶基因mRNA含量的线性范围为101～109pg/ml,批内和批间重复性测定的变异系数(cv)分别为6.52%～12.02%和8.76%～14.16%.APRIL在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃黏膜(P＜0.05),在胃癌组织中的表达水平又显著高于肠上皮化生和异型增生(P＜0.05),而其受体B细胞成熟抗原(BCMA)和穿膜蛋白活化物(TACI)在各种胃黏膜病变之间表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量,具有较好的灵敏度和重复性.APRIL在胃癌病变演进过程中呈现累积和渐进趋势,可能在胃癌发生、发展过程中起重要作用,有可能成为胃癌早期诊断和抗癌治疗的靶分子.肿瘤组织可能还表达APRIL未知受体.

摘要：目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQPCR)技术分析肝癌组织中增殖诱导配体(APRIL)及其受体mRNA的表达水平。方法在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量,并以靶基因和内参β2MmRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果RFQPCR检测靶基因mRNA含量的线性范围为10～109pg/ml,批内和批间重复性测定的变异系数v分别为3.87%～10.12%和6.86%～12.29%。20例肝癌组织样本的检测结果显示肝癌及癌旁组织中APRIL和BCMA的水平均显著高于远端正常组织(P0.05)。结论成功建立RFQPCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;而且发现APRIL在肝癌发生、发展过程中可能起了重要作用,有可能还参与了肿瘤细胞的转移,并主要是通过受体BCMA而不是TACI发挥作用。

摘要：目的建立实时荧光定量PCR(RFQ PCR)检测人B细胞激活因子(BLyS)mRNA含量的方法,初步探讨BLyS表达水平与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性。方法在BLyS基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,RT PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BLySmRNA含量,并以BLySmRNA和内参β2M mRNA含量的比值作为评价BLyS表达水平的指标。结果本法检测BLySmRNA含量的线性范围为109pg/ml～101pg/ml,批内和批间变异系数(CV)分别为2.4%～7.4%和4.3%～12.3%。SLE患者BLySmRNA表达水平(1.45±0.33)显著高于健康献血员(0.88±0.13),P<0.01,而且与血清IgG水平和抗ds DNA抗体滴度有显著相关性。结论建立RFQ PCR检测BLySmRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;BLyS在SLE的发生、发展及预后等方面可能具有重要作用。

摘要：目的:研究建立实时荧光定量(RFQ)-PCR法测定B淋巴细胞激活因子(BLyS)及其受体mRNA含量的方法,探讨其在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单一核细胞(PBMC)中表达的检测价值。方法:在BLyS及其受体基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,用反转录(RT)-PCR扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,用所建立的RFQ-PCR方法检测23例SLE患者、23名正常人外周血BLyS及其受体mRNA表达。结果:SLE患者B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B淋巴细胞活化因子受体(BAFF)-RmRNA的表达明显高于正常人(P<0.01),活动期患者的表达高于缓解期(P<0.01),抗ds-DNA抗体阳性和尿蛋白阳性的SLE患者BCMA、TACI和BAFF-RmRNA的表达高于阴性患者(P<0.01)。结论:RFQ-PCR检测BLyS及其受体mRNA含量的方法具有较好的灵敏度和重复性;SLE患者BLyS、TACI和BAFF-RmRNA表达含量升高,提示BLyS、TACI和BAFF-R可能与SLE的发病有关。

摘要：目的研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体(BAFF-R)含量的方法,及探讨其在外周血单个核细胞(PBMC)中BAFF-R mRNA表达的检测价值.方法在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针,用逆转录(RT-PCR)扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BAFF-R mRNA含量,并以 BAFF-R mRNA和β2M mRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价.结果 RFQ -PCR检测BAFF-R含量的线性范围为109 ～101 pg/ml,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为12.5%和11.9%,高浓度样本批内和批间CV分别为8.3%和9.3%.30名健康献血员样本的PBMC中,83%(25/30)有BAFF-R mRNA表达,范围为0.14～1.03.结论 RFQ -PCR检测BAFF-R mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性.

摘要：目的:建立实时荧光定量PCR(RFQPCR)检测人B细胞激活因子受体TACImRNA含量的方法,初步探讨健康献血员外周血单个核细胞(PBMC)中TACImRNA表达水平。方法:在TACI基因高保守区设计特异性的引物和荧光探针,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中TACImRNA准确含量,并以TACImRNA和β2MmRNA含量的比值作为评价TACI表达水平的指标。结果:本法检测TACImRNA含量的线性范围为109～101pg/ml,批内和批间重复性测定的CV分别为2.97%～9.32%和5.86%～10.29%。40例健康献血员样本的PBMC中35例(87.5%)检出有TACImRNA表达,范围为0.02～2.11。结论:成功建立RFQPCR检测TACImRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性,为进一步探讨TACImRNA表达水平与自身免疫性疾病发病机制之间的关系奠定了基础。

摘要：目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

摘要：目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV-RNA含量方法的临床应用价值。方法:在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,PCR扩增目的片段并构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的巢式RT-PCR进行定性分析。结果:138例样本在HCV抗体阳性患者中,肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(P<0.05),而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.91)。结论:RFQ-RT-PCR检测HCV-RNA含量比ELISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HCV在体内的复制情况。

摘要：目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。

摘要：目的构建实时荧光定量PCR(RFQ,-PCR的标准品以定量检测人B细胞激活因子受体。BAFF-R基因mRNA的表达。方法在BAFF-R基因高保守区设计了特异性的引物和荧光探针,用RT-PCR法从人外周血单个核细胞的总mR-NA中逆转录扩增BAJFF-R的cDNA,将纯化的BAFF-R cDNA与PGEM-T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后提取重组质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I进行酶切鉴定并测序分析,最后对质粒标推进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原被的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实TNF-αcDNAn重组到PGEM-T载体上。结论成功克隆了BAFF-R实时荧光PCR定量标准。