摘要：目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者用核苷类药物治疗不同时间段血清HBV P基因点突变的情况及临床意义。方法选取临床确诊CHB患者108例,并分别于接受拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定(L-dT)及序贯联合治疗前、治疗2年、治疗4年时,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,并检测血清中HBV P基因的变异情况。针对HBV P区目的位点设计引物,按照PyroMark ID遗传分析系统用单核苷酸多态性(SNP)模式进行PCR产物HBV P基因相关位点的焦磷酸测序。结果随着不同药物治疗时间的延长,血清中HBV DNA的含量均明显下降。108例患者治疗前均无HBV P基因变异;治疗2年时,有60例发生各种不同形式的单点或多点突变;治疗4年时,共有93例发生各种不同形式的单点或多点突变;3例采用序贯联合治疗的患者,≥2年全部发生突变。单用某种核苷类药物时,HBV P基因的变异情况随治疗时间的增加而明显增加;不同种类的药物之间,同样的治疗时间段内,HBV P基因变异情况未见明显差异。变异模式以经典突变M204V/I、L180M、A181V/T、N236T突变为主,存在少量V173L、S202G、T184G突变。结论 HBV P基因变异的发生与核苷类药物治疗及治疗时间密切相关。

摘要：目的观察核苷类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙肝病毒聚合酶(HBV P)基因准种变化及变异特点。方法运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,按照Pyro-Mark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物(HBV P基因相关位点)的焦磷酸测序和突变频率检测。108例慢性HBV感染患者中用药史明确者同期测定HBV DNA、HBV标志物、ALT。结果108例患者中,61例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,有少量V173L、S202G、T184G突变;其中40例用药史明确患者中,18例发生变异,发生变异者耐药突变型在样本中所占比例为20%-100%,HBV P基因变异可以在HBV DNA、ALT发生突变前、中、后检出。结论焦磷酸测序可以快速检测HBV P基因变异;变异株突变频率变化可初步反映HBVP基因准种异质性;HBV P基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关。

摘要：目的构建乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型全基因组序列克隆。方法从HBV无症状慢性携带者中筛选B、C基因型,提取病毒核酸,设计引物,应用高保真酶对3 200bp的HBV DNA进行全序列扩增,通过克隆技术构建pGEM-HBV重组质粒,测序后进行序列分析。结果获得HBV B基因型和HBV C基因型重组质粒各1株。结论成功构建HBV B基因型和HBV C基因型的全基因组序列克隆,可为进一步研究HBV分子流行病学和基础研究提供工具。

摘要：目的:建立一种准确、快速、实用的检测人乳头瘤病毒(HPV)16、58亚型的方法。方法:根据HPV16和HPV58亚型的序列特异性各设计一对引物和一对型特异性双链置换探针,采用实时荧光PCR扩增后,通过非高分辨的融解曲线分析在同一荧光通道内有效区分两种HPVDNA基因亚型。结果:1ng/μl、0.1ng/μl和0.01ng/μlHPV16和HPV58模板荧光PCR扩增及融解曲线分析显示,融解曲线分析较定量扩增更灵敏、特异。HPV16和HPV58融解曲线对应的Tm值分别为83.5°C和87°C。结论:所建双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线分析检测HPV16、58亚型的方法灵敏、特异,有临床应用价值。

摘要：目的利用重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)快速构建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆,观察重组质粒在Huh7细胞中的表达,建立HBV阿德福韦酯耐药株(RT A181T)的体外研究细胞模型。方法设计保守引物,从慢性乙型肝炎阿德福韦酯耐药患者血清中扩增全长HBV基因组,利用SOE-PCR技术构建1.3倍基因组长度的感染性克隆质粒pHBV1.3,转染肝癌细胞系Huh7,采Western Blot、Real-time PCR检测感染性克隆复制以及表达情况,同时用抗病毒药物拉米夫定以及阿德福韦酯验证对感染性克隆复制及表达的抑制情况。结果成功构建了HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T),该质粒在Huh7细胞系中能有效复制、转录和表达。拉米夫定能有效抑制该感染性克隆的复制和表达,阿德福韦酯不能抑制该感染性克隆的复制和表达。结论构建的HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T)在体外能高效复制及表达蛋白,其转染细胞可用于HBV复制机制及抗病毒研究。

摘要：目的:分析乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)阿德福韦酯耐药株的基因序列。方法:从已发生阿德福韦酯临床耐药的慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,设计保守引物,采用高保真聚合酶对耐药株HBV DNA进行全序列扩增,通过克隆技术构建PGEM-HBV重组质粒,测序后进行序列分析。结果:获得阿德福韦酯耐药的HBV DNA全长序列克隆,序列长度为3 261 bp,序列分析发现在逆转录区有rt A181V位点突变。结论:阿德福韦酯耐药株HBV DNA全长序列克隆的成功构建,为阿德福韦酯临床耐药性研究提供参考。

摘要：目的 :体外扩增中国株乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法:设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果:成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3(C)质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论:利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。

摘要：目的 :建立生物素—亲和素系统酶呈色方法用于DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性及临床应用。方法 :针对HBVDNA多个常见点突变位点 ,设计多条寡核苷酸探针 ,用点样仪将其固定于硅烷化芯片的特定位置上 ,经与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交 ,杂交结果影印至硝酸纤维素膜 ,经BCIP/NBT避光显色 ,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。结果 :通过一次杂交反应可检测HBV前C/C区 (nt1896/1814 )、BCP区 (nt1762 /1764 )和P区 (aa5 2 8/5 5 2 )等多个位点的变异 ,与测序分析结果符合率 97% ,具有较好的检测灵敏度和重复性。 15 6例乙肝患者HBV基因前C/C及BCP区检出基因突变 70例 (阳性率 44 .9% ) ,在 12 7例慢性肝炎组检出突变 60例 ( 4 7.2 % )、2 2例肝炎硬化组检出突变 8例 ( 3 6.4% )。结论 :酶呈色法DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性 ,操作简便易行 ,节省昂贵试剂与设备 。

摘要：目的　分析乙肝患者HBVDNA前C/C区和基本核心启动子区部分DNA片断突变。方法　PCR扩增HBVDNAnt1735～196 5片段,将产物进行HBVDNA测序。结果　在6 8例乙肝患者中,突变阳性率4 8. 5 % ,点突变16 8个,频率前10位的是nt176 4 ,176 2 ,1799,176 6 ,1896 ,175 4 ,1899,176 8,1814及1913,还检出鲜见报道的192 3,192 2 ,190 7等点突变。5 4例慢性肝炎和10例肝炎肝硬化患者HBVDNAnt1896 ,176 4 ,176 2点突变阳性数分别为9,19,19和3,19,19,两者差别有统计学意义(P <0 . 0 1)。结论　提示PreC/C与BCP区基因突变可能与肝实质纤维化相关联;基因测序对芯片探针设计有着十分重要的指导价值和临床意义;HBVDNA突变发生率较高,且位点众多,基因突变分析对肝炎诊疗与流行病学研究有着十分重要的意义。