摘要：目的建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物采用健康人O型红细胞悬液稀释成1000、500、200、50、10个/μL等不同虫密度血液样本,以荧光RAA/CRISPR-Cas12a法进行检测,评价检测效果。结果选择Pf-F3/Pf-R3/crRNA2作为引物组合、2.5μL作为B buffer添加量、40 min作为RAA反应时间和37℃作为CRISPR-Cas12a反应温度建立荧光RAA/CRISPR-Cas12a法,其可检出浓度为1拷贝数/μL的含恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因的质粒;该法检测恶性疟原虫可见荧光信号,但检测卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫及阴性对照均无荧光信号,且与梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等其他病原体亦无交叉反应。采用荧光RAA/CRISPRCas12a法和巢式PCR法分别检测50份疟疾临床样本,两种方法检测结果完全一致(kappa值=1.0,P<0.001)。恶性疟原虫3D7株经6d体外培养,获得10 mL培养物,采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测稀释后的临床样本,得到最低检测限为50个疟原虫/μL。结论荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测恶性疟原虫快速、敏感、特异,有望用于恶性疟原虫快速检测和风险监测。

摘要：精准医疗是在科技浪潮的推进下提出的,它通过基因组测序、生物信息、大数据科学等多学科交叉应用,为患者提供更加准确和精细的个体化医疗服务[1]。精准医疗对病理学提出新的挑战,更是注入了生机,以形态学为基础的传统病理诊断技术远远不能满足精准医学的临床需求,传统的病理学技术与分子生物学、信息遗传学以及蛋白质组学等多学科相互交叉相互渗透形成了分子病理学,可以为临床提供精准的医学信息和证据。因而,分子病理诊断是在传统组织病理学的基础上结合分子生物学及分子遗传学的研究成果,并采用相关的分子生物学技术逐渐发展完善起来的交叉学科,该学科主要运用分子和遗传学方法对肿瘤进行分子病理诊断和分类,设计和验证能够反映预测疾病发生、治疗敏感性、病情发展等方面的生物标志物,为临床医生提供有价值的患者个体化资料,从而做到有针对性的个体化综合治疗。

摘要：病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

摘要：目的针对HBV C编码链设计合成反基因锁核酸(locked nucleic acid,LNA)片段,以HepG2.2.15细胞为研究对象,筛选并鉴定出能特异性阻断HBV复制和表达的有效治疗靶点药物。方法利用RNAstructure 5.0软件针对HBV C区编码链1914~1928 nt、1969~1983 nt、2002~2016 nt、2053~2067 nt、2069~2073 nt、2162~2176 nt和2404~2418 nt位点设计合成7条反基因LNA片段(分别以SQ1~SQ7表示),以阳离子脂质体lipofectamine 3000(lipo3000)介导转染HepG2.2.15细胞,隔3天对应给药,连续给药3次,分别于给药后第3、6、9天收集培养上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBeAg水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)测定HBV-DNA浓度。结果针对HBV C区编码链2162~2176 nt(SQ6)和2404~2418 nt(SQ7)位点的反基因LNA片段对HBV-DNA复制和HBeAg表达的抑制效果最明显,用药后第3、6、9天,SQ6对HBeAg的平均抑制率分别为43.91%、59.95%和59.07%,HBV-DNA则分别为42.91%、50.09%和51.14%;SQ7对HBeAg的平均抑制率分别为44.18%、60.81%和60.02%,HBV-DNA则分别为47.28%、54.16%和52.22%。结论针对HBV C区编码链2162~2176 nt和2404~2418 nt位点的反基因LNA片段体外能有效抑制HBV的复制和表达,为抗HBV治疗提供一定的理论依据和实验依据。

摘要：目的针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)前S1 dsDNA同聚嘌呤区设计反基因寡核苷酸药物-锁核酸(locked nucleic acid,LNA),并在体外观察抑制HBV复制的效果。方法针对HBV前S1 dsDNA的3023~3037 nt、3094~3109 nt两个同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计并合成LNA,以阳离子脂质体为载体,将药物转染入HepG2.2.15细胞内,采用荧光定量PCR技术和化学发光免疫技术分别检测3 d、6 d和9 d细胞培养上清液中HBV DNA和HBsAg的含量;CCK8法检测锁核酸对HepG2.2.15细胞代谢的影响。结果LNA对HepG2.2.15细胞的HBV DNA转录和HBsAg表达有显著的抑制作用,并且抑制效果随着时间进一步加强,在第9天的抑制率分别为45.37%和52.09%。两个同聚嘌呤组与空白对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05),而封闭3023~3037nt同聚嘌呤区的LNA抑制作用较强,且最适序列长度为15~25 bp。CCK8实验显示LNA对HepG2.2.15细胞无任何明显的代谢影响。结论针对前S1 dsDNA同聚嘌呤区的反基因锁核酸分子在体外能够有效地抑制HBV的复制,以封闭3023~3037 nt靶位效果较强,且合适序列长度为15~25 bp。