摘要：目的制备呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前构象(pre-F)mRNA疫苗,进行可行性验证。方法对抗原基因进行密码子优化设计,分别连接至pGEM-3Zf-N3载体上,通过质粒线性化、体外转录、纯化和Cap1加帽处理,得到功能性mRNAs。在转染至293T细胞后,利用Western blot和间接免疫荧光试(IFA)来确定目标蛋白的表达情况。通过微流控装置制备LNP/mRNAs疫苗免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体效价,评估免疫效果。结果成功构建重组质粒Pre-F-GCN4t和mDS-Cav1,通过双酶切验证条带符合预期大小。表达目的抗原大小为57.57 ku和64.35 ku。成功检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体,Pre-F-GCN4t免疫组的效果优于mDS-Cav1组,3次免疫较2次免疫提升了2倍,抗体效价最高可达1∶4×10^(4)。结论两种抗原设计模式均具有可行性,Pre-F-GCN4t的设计方式对于激活机体的体液免疫应答更有优势,mRNA疫苗无需体内转录,为呼吸道合胞病毒mRNA疫苗的优化设计提供理论基础。

摘要：目的设计猴痘病毒(MPXV)抗原,选择多种方案设计抗猴痘病毒mRNA候选疫苗,并完成其表达鉴定及小鼠体内的免疫效果评价。方法选取猴痘病毒M1R、A35R、A29L、H3L基因设计三组候选抗原基因(命名为:M1RA35R、A29L-H3L-A35R、A35R-Fc),并设置一组痘苗病毒(VACV)基因(L1R-A33R)作为对照,分别连接至mRNA制备专用载体pGEM-3Zf-n3,通过线性化、体外转录、纯化和加帽获得功能性mRNA,利用Western blot、IFA对目的抗原进行鉴定。通过微流控芯片制备LNP-mRNAs疫苗,制定免疫程序并完成小鼠的免疫及特异性抗体水平监测。结果成功构建3组抗猴痘病毒的mRNA疫苗和1组抗痘苗病毒的mRNA疫苗,四组疫苗均能表达抗原蛋白,并且制备的4组LNP-mRNAs疫苗在免疫后84 d仍维持较高的特异性抗体水平。结论成功完成猴痘病毒mRNA疫苗的构建、表达及鉴定,并通过对不同猴痘病毒抗原设计的验证,为以后猴痘疫苗的研发提供数据支撑。

摘要：目的设计抗H5N1亚型流感病毒的通用型mRNA疫苗,并完成候选疫苗的构建、表达及鉴定。方法设计3组候选疫苗抗原基因,分别命名为Flu、Flu-ferritin和CD5-Flu-ferritin(Flu含H1/H3/H5/B型流感病毒血凝素颈部区保守表位,并串联甲型流感病毒M2e基因中保守序列;Flu-Ferrin在Flu后串联铁蛋白,用以形成多聚体;CD5为分泌型信号肽,将多聚体外泌)。3组基因依次克隆至设计的mRNA疫苗骨架载体上,通过质粒鉴定、线性化处理、体外转录、纯化、及Cap 1加帽处理,分别制备mRNA并转染A549细胞,通过Western blot和IFA方法鉴定目的蛋白的表达。结果成功构建3组mRNA候选疫苗,并在A549细胞上表达抗原蛋白。结论证明了抗原设计的可行性,为开展动物试验奠定了基础。

摘要：原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。

摘要：目的探讨H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒的拯救并进行鉴定,为新型流感疫苗的研发奠定基础。方法采用脂质体转染的方法,首先依照A型流感病毒A/PR/8/34 HA嵌合片段的设计对H5 2.3.4.4谱系HA和H7亚型的HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合减毒株,对拯救成功的病毒株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定病毒滴度;从中选择H5亚型嵌合减毒株以10~4EID_(50)/50μl的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察、记录小鼠的体重变化及死亡情况,并测定攻毒后第3 d及第6 d小鼠肺脏病毒复制能力。结果成功拯救出2种A/B型嵌合减毒株,分别命名为rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110,测序显示两株嵌合减毒株的序列与预期一致,并在电镜下观察到了流感病毒样粒子。rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110株在MDCK细胞上的病毒滴度均为10^(4.50)TCID_(50)/ml;在鸡胚上的病毒滴度rA/B-H5-NS110为10^(5.25)EID_(50)/ml,rA/B-H7-NS110株为10^(5.44)EID_(50)/ml。小鼠致病性实验中H5亚型嵌合病毒感染组小鼠与对照组相比体重无明显下降,攻毒后小鼠存活率100%;攻毒后第3 d可在小鼠肺脏内检测到嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的轻微复制,第6 d时未检测到病毒复制。结论成功地拯救出2株包含有H5 2.3.4.4谱系HA基因以及H7N9流感病毒HA基因的嵌合减毒株,为B型流感病毒包装机制的研究以及新型流感疫苗的研发提供了新的思路。

摘要：为建立能够检测猪博卡病毒（PBoV）所有基因型的检测方法，本研究根据PBoV每个基因群（G1、G2和G3）的保守区域设计特异性引物，建立了检测PBoV的PCR方法。特异性试验结果显示除PBoV外，其它猪病病原核酸扩增均呈阴性，具有较强的特异性；对pMD-GD6、pMD-GD18和pMD-GD4的最低检测限分别为4.64×10^3拷贝/μL、 5.29×10^3拷贝/μL和1.16×10^3拷贝/μL，敏感性较高；采用该方法对39头份猪的肝脏、肺脏、脾脏和小肠内容物进行检测，阳性率为74.4 % （29/39）。其中G1群PBoV的检出率最高，G2群检出率最低；G1群和G3群在4种样品中均有检出，G2群只在小肠内容物中有检出；同时本研究首次在肝脏中检出该病毒。本研究结果表明，PBoV感染情况复杂，存在多基因型的混合感染。本研究为进一步对病毒进行基因分型和致病性研究提供检测依据。

摘要：以转赖氨酸基因小鼠为研究对象,根据转入基因的载体结构分别设计赖氨酸基因、新霉素抗性基因、转基因启动子及小鼠基因组内参基因特异性引物,优化反应条件,建立转基因小鼠多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法可以用于转赖氨酸基因小鼠的检测,同时为转基因动物检测标准的建立提供试验依据。

摘要：以本实验室扩增的内蒙猪圆环4型病毒(PCV4)毒株的ORF2基因序列为参考,对其密码子进行优化并送往公司进行质粒合成,通过设计特异性引物,扩增出Cap蛋白基因。将目的基因克隆至pET-28a载体,构建出pET28a-PCV4-Cap重组表达质粒。将重组质粒转化至表达宿主菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,制备PCV4 Cap重组蛋白。优化表达条件和SDS-PAGE分析结果显示,Cap重组蛋白能够在沉淀中大量表达且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、37℃诱导6 h条件下表达量最高,其约为27 kDa。经Western blot验证,条带单一,与预期结果相同。本试验结果为了解PCV4 Cap蛋白及建立PCV4血清流行病学快速检测方法奠定了基础。

摘要：试验设计了椰子油组和对照组2个处理。采集育成猪肝脏组织,进行转录组高通量测序,找出2种处理间的差异表达基因及差异代谢通路。利用Illumina Hi SeqTM2 500高通量RNA-seq测序技术测序,使用Top Hat2软件将测序得到的reads序列与猪参考基因组(Sscrofa10.2)序列比对,找出差异表达基因,并在Nr、GO和KEGG数据库中进行功能注释、富集分析和聚类分析。结果表明:椰子油组和对照组肝脏中差异表达基因共有487个,与对照组相比,椰子油组表达上调的基因有222个,下调的基因有265个。在差异表达上/下调前15位基因中,有多个基因是参考基因组中没有的新基因和功能未知基因。GO功能分类注释到细胞组成、分子功能和生物学过程数据库中的差异表达基因数分别有398、368个和398个;注释到KEGG通路中差异表达基因数188个。

摘要：从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将该毒株命名为YN—LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征，根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物，对YNI。Q株全基因进行扩增及测序，将测序结果依次拼接获得YN—LQ株的全基因序列，并进行序列的比对分析。结果显示：PRRsVYN—LQ株基因组全长为15320bp；将YN—LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析，发现YN—LQ株与JXAl的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99．0％，其氨基酸序列有15个位点发生了改变；GP5基因序列同源性为97．7％，其氨基酸序列有9个位点发生了改变；全基因的同源性为98．7％。证实该毒株为JXA1变异株，为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。