摘要：目的建立一种将DNA提取技术与PCR技术相结合的天麻DNA真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的ITS2序列,应用DNAMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用DNA提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组DNA,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果应用所研制的试剂盒提取样品DNA,纯度OD260/OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^(-1),3次重复性检测结果相同,反复冻融5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。

摘要：本研究针对平贝母的ITS2序列设计特异性鉴别引物,优化反应体系及条件,构建PCR-核酸试纸条实现可视化检测平贝母。通过分子克隆及测序技术,构建平贝母DNA阳性对照品,制定质量标准。对建立的方法进行性能评价,检测其灵敏度、特异性和重复性,对市售样品进行真伪鉴定。结果显示,基于ITS2序列可对平贝母及其混伪品进行区分。正品平贝母PCR产物滴定于试纸条上显示T、C线两条带,伪品与阴性对照只显示C线一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合。特异性为100%,PCR-核酸试纸条灵敏度可达0.1 ng·μL^(-1),高于凝胶电泳检测10倍。16个平贝母市售样品中11个合格,5个不合格。综上,本研究建立的平贝母PCR-核酸试纸条检测方法特异、快速、精准、可视化,可为平贝母检测提供新的技术思路。

摘要：目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组DNA的灵敏度为1 pg·μL^(-1),比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。

摘要：目的:蛤蚧为我国的名贵中药材,建立PCR-核酸试纸条检测方法对蛤蚧进行定性鉴别。方法:通过碱裂解法提取蛤蚧及其伪品的基因组DNA,以蛤蚧细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)为靶基因,设计特异性引物,确定合适的PCR-核酸试纸条反应体系以及反应条件。结果:通过PCR-核酸试纸条对蛤蚧进行定性分析,正品蛤蚧在PCR-核酸试纸条上均出现2条带,伪品以及阴性对照均出现1条带。结论:PCR-核酸试纸条检测方法可实现短时间内蛤蚧可视化检测,操作方便,结果准确,可以为蛤蚧的DNA分子鉴别提供技术保障。

摘要：目的通过聚合酶链式反应(PCR)与层析试纸条结合的方法,实现天麻快速可视化真伪鉴别,并对其检测效果进行评价。方法采用一步法提取天麻及其伪品基因组DNA,应用NCBI数据库设计天麻特异性引物。采用DNA分子克隆技术制备天麻阳性质粒,作为天麻阳性对照品。建立PCR-层析试纸条法鉴定天麻真伪,摸索最优实验条件,并进行方法学评价。结果①样品DNA提取的纯度符合要求,最优的PCR反应引物浓度为1μmol/L,循环为29次。②分子克隆的天麻阳性质粒序列与天麻DNA分子标记特异性指纹区片段序列同源性为98%,可作为天麻PCR-层析试纸条法的阳性对照品。③PCR-层析试纸条法的方法学评价结果显示:天麻对照药材在试纸条上出现两个条带,伪品和阴性对照品出现1个条带,与琼脂糖凝胶电泳法结果一致,特异性良好;PCR-层析试纸条法较琼脂糖凝胶电泳法的灵敏度高100倍,天麻DNA浓度为10-1 mg/L时,试纸条仍有模糊条带;在第3、6、9、12个月采用PCR-层析试纸条法进行检测,检测结果与预期一致,稳定性良好;混合样品验证显示,PCR-层析试纸条法的最低检测限为10%,而琼脂糖凝胶电泳法的最低检测限为50%。④采用PCR-层析试纸条法对15份市售天麻样品进行检测,鉴别出3个伪品,与琼脂糖凝胶电泳法结果一致。结论所构建的PCR-层析试纸条检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便快速,可在短时间内实现鉴定结果的可视化,检测结果准确、稳定,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了新方法。