摘要：目的探讨 mdr1短发夹 RNA(mdr1 shRNA)对人红白血病耐阿霉素细胞系 K562/ADM的耐药逆转作用。方法编码设计合成靶位 mdr1基因 mRNA 具有19个碱基发夹结构互补的寡核苷酸模板,构建2个 shRNA 表达载体 pSilencer^(TM)3.1-H1 neo mdr1-A和 mdr1-B,将其稳定转染 K562/ADM细胞。用 RT-PCR 法检测转染后 K562/ADM 细胞 mdr1 mRNA 表达,Western blot 检测 P-糖蛋白(P-gp)表达,流式细胞术和 MTT 法分别检测 K562/ADM 细胞凋亡和对阿霉素的敏感性,用激光共聚焦荧光显微镜观察并测定细胞内柔红霉素的积累。结果在 pSilencer^(TM)3.1-H11 neo mdr1-A 和 mdr1-B shRNA表达载体稳定转染的 K562/ADM 细胞,mdr1 mRNA 表达分别减少到转染前的35.9%(P<0.05)和27.5%(P<0.01);同时 Western blot 结果显示 P-gp 表达被明显而特异地抑制,对阿霉素的耐药性由79倍分别减低到38倍和30倍;并且,细胞内荧光强度与对照组相比显著增加(P<0.05),与阿霉素联合应用凋亡细胞百分率分别增加至18.1%(P<0.05)和54.4%(P<0.01)。结论靶向 mdr1基因shRNA 表达载体可有效逆转耐药,使耐药的肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性。

摘要：目的:探讨RNA干扰技术沉默Ras homolgyC(RhoC)对卵巢癌细胞SKOV3细胞运动和侵袭力的影响。方法:利用Invitrogenis RNAi Designer软件设计并构建RhoC的干扰RNA(miRNA)载体,利用质脂体介导法将RhoC miRNA及非特异miRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,经blasticdin进行稳定筛选出抗性克隆;将实验分为RhoC miRNA组(转染特异miRNA)、非特异miRNA组(转染非特异性miRNA)、空白对照组(不转染RhoC miRNA)。Western blot检测3组卵巢癌细胞中RhoC蛋白表达水平;同时检测对卵巢癌细胞体外运动及侵袭的抑制作用。结果:SKOV3细胞稳定转染后,转染特异性miRNA组RhoC蛋白表达量[0.1989(4257/21498)]与转染非特异miRNA组[2.142(38245/17855)]和空白对照组[2.604(48872/18768)]相比,差异均有统计学意义(P0.05);体外细胞运动实验表明,转染特异性miRNA组与转染非特异性miRNA组及空白对照组跨膜细胞数[分别为(52±3)个、(401±28)个及(432±28)个/高位镜(×200)]比较,差异均有统计学意义(P0.05)。重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验显示,以上3组穿透基底膜细胞数[分别为(48±9)个、(386±26)个及(424±25)个/高位镜(×200)]比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:抑制卵巢癌SKOV3细胞RhoC蛋白的表达对卵巢癌细胞的运动及侵袭有抑制作用,这可能为卵巢癌转移的基因治疗提供新的靶点。

摘要：目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI3130测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4d后,给予强力霉素(4mg.L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内表达受到抑制。结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。

摘要：目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。

摘要：肿瘤细胞的侵袭及血行转移是一个多步骤的、肿瘤细胞与宿主细胞相互作用的生物学过程,与肿瘤治疗的远期效果密切相关.大致步骤是原发灶肿瘤细胞的增殖;肿瘤细胞自原发灶游离,侵袭穿过细胞外基质和血管基底膜、游走至血管内;血液循环中的肿瘤细胞逃避免疫监视、与转移部位的血管内皮细胞相粘附,并穿过血管内皮细胞、游走至血管外;肿瘤细胞转移至目标脏器并增殖.针对肿瘤侵袭、转移的各个环节所设计的特定治疗方案可以有效地抑制肿瘤的侵袭和转移.

摘要：目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12p35与p40基因片段。利用KpnⅠ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用KpnⅠ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果:通过PCR分别获得约1000bp大小的p40基因片段与600bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1600bp左右的拼接产物,采用KpnI内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1000和600bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1600bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。

摘要：体视学定量分析技术在病理学领域研究中的应用具有相对特殊性。如何针对不同组织、细胞、亚微结构及分子水平的病变特点,科学地设计定量分析的采样方法、代表性样品大小、测试方法及测试参数等多个环节,不仅对于提高体视学定量分析的客观性、重复性及科学性具有重要作用,而且对于揭示病变的特点,创新病理学科理论具有重要意义。我们结合近年来从事病理学体视学定量分析研究工作的实际,讨论如何优化设计体视学定量分析技术在病理学研究领域中的应用问题。

摘要：目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。