摘要：目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI3130测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4d后,给予强力霉素(4mg.L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内表达受到抑制。结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。

摘要：目的探讨水通道蛋白1(AQP1)基因沉默对在前列腺癌PC-3细胞的作用。方法培养PC-3细胞至对数生长期,随机分为质粒转染组和质粒空白组。针对AQP1基因设计合成小片段RNA,并构建高效表达载体。利用转染试剂LipofectamineTM2000用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染入PC-3细胞。RT-PCR检测PC-3细胞AQP1 mRNA的表达情况及激光共聚焦观察室观察、拍照AQP1表达的情况,转染后72 h。将鼠龄为6 w的60只BALB/c(nu-/nu-)雄裸鼠随机分成两组,其中对照组30只,转染组30只。转染组把转染后的前列腺癌PC-3细胞注射裸鼠腋窝处皮下(对照组把未经转染的前列腺癌PC-3细胞注射到裸鼠腋窝处皮下)。每日观察肿瘤生长及体重情况,裸鼠饲养6 w处死,完整取出移植瘤瘤体测量体积和重量。结果与质粒空白组相比,转染组应用RNA干扰技术后AQP-1在前列腺癌PC-3细胞系中mRNA的水平降低,与对照组相比,转染组裸鼠移植瘤体积为(573.39±175.24)mm3明显小于对照组(1 482.50±327.86)mm3(P=0.03)。转染组肿瘤重量为(0.55±0.11)g明显小于对照组〔(1.31±0.29)g,P=0.027〕。结论 AQP-1广泛的表达在正常前列腺组织和前列腺癌组织中,对内环境稳态起着重要的作用。更多的AQP-1促进了前列腺癌细胞的增长,抑制AQP-1的表达可以使前列腺癌移植瘤生长减慢,体积减小。

摘要：目的设计漏斗形生物降解材料输尿管内支架,探讨该支架在上段输尿管梗阻治疗中应用的可行性。方法制备己内酯丙交酯乙交酯三元共聚材料(PCLGA 20:60:20),并加工成漏斗形支架管。雄性家犬4只,体重12-15 kg,通过手术方法建立输尿管上段不完全梗阻动物模型;在此基础上行输尿管狭窄段切除吻合术,术中留置漏斗形PCLGA支架管支撑引流;术后定期行IVU检查,并于术后12周行术侧输尿管组织病理学分析。结果4只犬成功建立输尿管上段梗阻动物模型。漏斗形PCLGA支架管内引流效果良好,肾盂及输尿管扩张积水逐渐缓解;6-8周支架管密度减低,陆续发生断裂,断裂的支架管并未造成输尿管梗阻;术后12周支架管完全降解并排出体外,吻合段输尿管无狭窄,造影剂通过顺畅,局部组织病理学改变轻微,仅见移行上皮细胞增生和固有层增厚。结论漏斗形PCLGA支架管生物相容性良好,降解时间适宜,在上段输尿管手术中具有良好的内引流效果。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默血小板源性内皮生长因子基因(platelet-derived endothelial cell growth factor,PDECGF)表达诱导人膀胱癌细胞凋亡的机制。方法针对人PDECGF mRNA序列设计合成编码干扰RNA(siRNA)的DNA模板,siRNA;构建含RNA聚合酶启动子Ⅲ转录载体pRNAT-U6/Neo并能形成发夹结构小干扰RNA(siRNA)的psiPDECGF质粒;用其转染人膀胱癌T24细胞株,采用RT-PCR、Western印迹法观察转染前后PDECGF基因及相关基因表达变化,采用凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳及吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡。结果显示PDECGF siRNA对膀胱癌T24细胞中PDECGF基因表达产生明显抑制作用;转染psiPDECGF-2细胞组PDECGF mRNA水平明显降低,上述重组质粒可诱导T24细胞凋亡,同时caspase-3、p53蛋白水平明显增高。结论证实psiPDECGF-2可抑制PDECGF在T24细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。其机制与caspase-3、p53蛋白水平表达增高有关。