摘要：牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)感染是国内近年来报道的一种临床上以消化道、呼吸道症状为特点的新发传染病,其病原体为小RNA病毒科肠道病毒属中的成员。目前,BEV分为EV-E和EV-F 2个病毒种,两者间的核苷酸序列差异很大,属于不同的血清型/基因型,常规血清学方法难以将其区别。为建立一种鉴别EV-E和EV-F病毒的方法,本研究根椐GenBank已发表的EV-E和EV-F肠道病毒的基因组序列,设计合成引物,建立了鉴别EV-E和EV-F的复合PCR方法,并确定了该方法的特异性、敏感性和重复性。同时,应用该方法检测吉林省长春地区疑似BEV感染样品。结果显示,建立的方法具有良好的特异性,只能检测出EV-E或EV-F肠道病毒,而牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒等病原检测均为阴性。敏感性试验结果显示,EV-E和EV-F最低检出量分别为3.67×10^(2),5.21×10^(3)拷贝/μL。检测长春地区的32份牛粪便样品的结果显示,EV-E和EV-F病毒的检出阳性率分别为28.13%和34.38%,两种病毒混合感染率为15.63%,与间接ELISA检测方法结果一致。上述结果表明,本试验建立的复合PCR方法具有特异性强,灵敏度高、快速与简便等特点,可用于EV-E和EV-F两种肠道病毒的鉴别诊断及流行病学调查。

摘要：过氧化物氧还酶6(peroxiredoxin6,Prdx6)是一种双功能蛋白质,具有GSH过氧化物酶和磷脂酶A2活性。前期研究构建布鲁氏菌强弱毒株感染绵羊白细胞层SSH c DNA文库,发现Prdx6在不同毒力布鲁氏菌感染时存在一定的差异性表达,推测Prdx6可能在布鲁氏菌感染中发挥一定的作用。为了更好地研究其在生物体中的作用,以RT-PCR技术,提取小鼠巨噬细胞系RAW264.7总RNA,反转录制备c DNA,设计特异引物克隆Prdx6开放阅读框核酸序列,并构建原核表达载体,进行原核表达,以镍柱纯化获得纯度较高的Prdx6蛋白,免疫家兔制备高特异性、高灵敏度的鼠Prdx6兔源多克隆抗体,为后续进一步研究Prdx6蛋白功能提供科学依据和应用工具。

摘要：本试验旨在构建用于核酸适配子筛选的随机寡核苷酸文库并对筛选过程中的PCR条件进行优化。利用Primer Premier 5.0构建了随机寡核苷酸文库并据文库两端固定序列设计引物,对对称PCR和间接不对称PCR中的上、下游引物的比例、模板量、退火温度、循环数等条件进行优化并验证其重复性,得到了对称PCR和间接不对称PCR的最佳反应条件,获得较理想的dsDNA和ssDNA并具有良好的重复性。本试验成功构建了寡核苷酸文库,优化了PCR条件,为适配子筛选和后续试验奠定了一定的基础。

摘要：为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%~2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p<0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。

摘要：试验旨在对羊白介素1受体颉颃因子(interleukin-1receptor antagonist,IL-1Ra)基因进行全长cDNA克隆及生物学分析。根据布鲁氏菌感染羊白细胞层SSH cDNA文库中的IL-1Ra基因序列信息及已知核苷酸序列(GenBank登录号:KC425613.1)设计引物,利用RT-PCR结合RACE方法扩增并克隆IL-1Ra基因,对其进行序列及相关分子特性分析。结果表明,羊IL-1Ra基因全长为1 228bp,可编码174个氨基酸,含有1个完整的IL-1保守结构域和1个IL-1Ra结构域(PHA02651结构域)。IL-1Ra分子质量为19 765.8u,等电点(pI)为5.72,其分子式为C_(88)5H_(1385)N_(235)O_(256)S_(11),且含有信号肽。二级结构分析显示,IL-1Ra分子存在较多的β折叠及受体结合位点,与三级结构预测结果一致,且与人/鼠IL-1Ra分子的空间结构相似度极高,达到90%以上。羊IL-1Ra有IL-1特有的三叶草结构,其酶结合结构域位于TYR^(47)至GLU^(66)之间。将羊IL-1Ra与牛、虎鲸、宽吻海豚、猪、家犬、人、鼠等14个物种进行蛋白质同源性比对,发现在各物种间存在5个高度同源的半胱氨酸位点。系统进化树分析发现,羊IL-1Ra基因全长cDNA所编码的氨基酸序列同山羊、牛单独形成一个分支。本研究结果为今后深入研究IL-1Ra基因的生物学功能奠定了基础。

摘要：本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-q PCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×10~2CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6～7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。