摘要：结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单链抗体(Single chainFv fragment,scFv)核苷酸序列,经分子设计和密码子优化后,通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain Fv fragments,scdsFv)基因片段.将凋亡素基因(Apoptin)通过一段柔性连接肽(Linker)连接在CEA scdsFv基因下游,并克隆入大肠杆菌表达载体质粒pET28a,转化BL21感受态菌后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达融合蛋白***-PAGE和Western-Blot分析表明,目的蛋白得到良好表达,经条件优化后表达量最高可达44.1 mg/L.融合蛋白经分步洗涤法和谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行初步纯化和复性后,利用人肝癌细胞(HCC)对所制备融合蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性分析.结果显示,所制备融合蛋白不仅能够有效地与上述肿瘤细胞结合,并对其具有明显的杀伤活性,表明成功制备了具有特异性识别和特异性杀伤活性的双特异抗肿瘤免疫导向制剂.

摘要：为评价Serpin基因重组表达产物对预防鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,***)感染的效果,克隆和表达*** Serpin基因,对表达产物进行初步纯化和复性,制备免疫原。设计了重组蛋白肌肉注射组、重组蛋白口服组、重组蛋白滴鼻组3个试验组以及红、白对照组。分别于7、14和28日龄对雏鸡进行3次免疫,35日龄时用3×104个***孢子化卵囊攻虫,第7天末宰杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析。结果表明,各免疫组的平均增重与红对照组相比均有显著增加(P<0.05),其中以重组蛋白肌肉注射组增重最多,相对增重率为66.73%,优于其他免疫组;各免疫组卵囊产量较红对照组均有显著的下降,其中重组蛋白肌肉注射组卵囊减少率最高,为30.01%;各免疫组ACI均明显高于红对照组,其中以重组蛋白口服组最高,但仍低于160,暗示Serpin蛋白并不是一个理想的球虫疫苗保护性抗原。

摘要：针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

摘要：为研究胸膜肺炎放线杆菌(APP)三聚体自转运黏附素(TAAs)的功能,以GenBank登录的APP血清5b型自转运黏附素基因5'端的3875bp序列设计引物,通过PCR的方法首次获得APP血清8型运黏附素N端的基因序列片段,测序结果与已知血清型的基因序列和氨基酸推导序列分别进行比对,结果表明与血清7型自转运黏附素N端同源性达到93%,氨基酸推导序列同源性达到97%;与血清5b型自转运黏附素N端同源性达到92%,氨基酸推导序列同源达到100%。经软件分析获得的序列含有与细菌的黏附、聚集和侵入密切相关的Hep_Hag基序,应用马克斯-普朗克研究所的在线分析TAAs的基序和蛋白域的软件daTAA,进行预测并证明所得序列为TAAs,并且具有完整的N段头部序列,有重要功能区具有良好的抗原性。比对的结果为寻找研究APP的定植基序和毒力因素提供了重要基础。

摘要：文献表明糖链在人参皂苷(ginsenoside,GS)的构效关系中占有重要地位[1],一些学者发现GS酶解后生成的脂肪酸酯类化合物[2-3]具有更强抗癌活性,本课题前期工作证实对人参总皂苷(TSPG)进行硫酸(酯)化修饰是可行的,且TSPG经硫酸化修饰后体外对淋巴细胞的增殖活性有促进作用.

摘要：目的探讨原核表达稀释复性的可溶性人FcγRⅡa（shuFcγRⅡa）的胞外区蛋白在体外与配体的结合活性。方法应用PCR技术从重组质粒pc3huRⅡ中扩增huFcγRⅡa的胞外区基因，将其克隆于原核表达载体pET-28a中。所构建的重组质粒经PCR和酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，制备融合蛋白包涵体。并采用多次洗涤法分离和纯化包涵体，用稀释法对纯化后的目的蛋白进行复性，ELISA和流式细胞术测定重组shuRⅡ在体外与配体的结合活性。结果扩增到了huFcγRⅡa的胞外区基因，所构建的pETshuRⅡ重组质粒经PCR和酶切鉴定与设计序列一致。转化B121（DE3）后，IPTG诱导目的蛋白表达率约为30％。SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为24．8×10^3，与理论预期值一致。破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达，经多次洗涤后蛋白纯度大于90％。ELISA法测得重组shuRⅡ与人IgG在体外有良好的结合活性，流式细胞术测得重组shuRⅡ对配体与受体结合有抑制作用。结论本复性方法可得到和天然蛋白类似生物学活性的目的蛋白。

摘要：生长抑素(SS)是一种多功能的脑肠肽,在动物生长轴中主要作为生长激素(GH)的负性调控因子。本研究通过慢病毒表达质粒介导shRNA,瞬时转染自身表达SS的BHK-21细胞,筛选出了靶向小鼠SS的最有效的siRNA序列。首先,分别在小鼠SS基因mRNA的246、433和539bp处找到潜在靶位点,合成3条siRNA转录模板的发夹结构以及1条阴性对照,体外退火后插入pshRNA-copGFP lentivector构建重组质粒。然后,通过对转染BHK-21细胞的荧光观察、Real-time PCR、免疫组化以及RIA等检测,转染细胞SS在mRNA水平及蛋白水平均检测到不同程度的抑制(P<0.05)。其中,psh2(SS 433～451)表现出了最高的沉默效率(转染效率68.9%时,mRNA水平的沉默效率达59.3%,P<0.05;蛋白质水平的沉默效率达55.6%,P<0.05)。本研究为降低SS在动物体内的分泌,相应提高GH的浓度,进而为促进动物生长的研究奠定了基础。

摘要：根据GenBank发表的Eimeria tenella serpin(Etserpin)基因设计1对引物,从孢子化卵囊总RNA中用RT-PCR方法扩增Etserpin基因,克隆后测序,应用生物信息学分析预测其核苷酸及其编码蛋白的结构与功能。结果表明,Etserpin开放阅读框为1 248bp,编码一分泌蛋白,N端具有1个28aa的信号肽,有1个跨膜区域,有2个糖基化位点和21个磷酸化位点,88,89,98～101,208～212,283～287,302～304区段是其可能的B细胞表位;同源性比对与进化树的分析表明其为抑制性serpin蛋白,结构保守,与***、***和***亲缘关系较近。二级结构以!螺旋和随机卷曲为主,具有类似于serpin家族蛋白的三级结构。

摘要：为了解牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增牛蛙皮肤抗菌肽基因,克隆得到cDNA全长序列并进行测序和序列分析。用生物信息学软件分析其cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质。结果得到48个完整的cDNA序列,分别编码24种抗菌肽前体,它们均由信号肽、前导肽和成熟肽3部分组成。对序列测定结果的预测分析表明,牛蛙皮肤抗菌肽前体核苷酸序列与已报道的其他蛙类抗菌肽具有较高的同源性,同源性达到80%以上,但成熟肽的序列变异很大,具有物种特异性,其中6个为新的抗菌肽序列。牛蛙皮肤抗菌肽成熟肽的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主,均为疏水性短肽。

摘要：Temporins是从蛙属中得到的一类羧基端酰胺化的疏水性抗菌肽,具有抗细菌、霉菌、酵母菌、原虫及病毒活性.为了研究牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及其结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,从牛蛙皮肤cDNA文库中克隆到两个新的temporins家族抗菌肽,命名为temporin-La(LLRHVVKILEKYLamide)和temporin-Lb(LFRHVVKIFEKYLamide).合成的temporin-La和temporin-Lb肽具有很强的抗菌活性,尤其是对革兰氏阳性细菌.溶血性测定结果表明,temporin-La浓度高至250mg/L时对兔红细胞仍无溶血活性,而temporin-Lb具有较弱的溶血活性(半数致死浓度LC50≈230μmol/L).通过透射电镜观察temporin-La和temporin-Lb处理过的金黄色葡萄球菌的细胞结构,发现它们都能直接地杀死细菌,但作用机制不一样.