摘要：目的:克隆幽门螺杆菌(Hp) hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构。方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性。原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni^(2+)亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件。结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300。HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白。HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为6.87%,无规则卷曲为38.63%。抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的5个优势线性表位和3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位。同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕。HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在0.2 mol·L^(-1)氯化镁、 0.1 mol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L^(-1)己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体。结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础。

摘要：目的构建针对人高迁移率族蛋白A1(HMGA1)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础。方法设计合成特异性针对人HMGA1基因的寡核苷酸序列,梯度退火后,与pU6mRFP载体连接,构建重组载体,转染人肝癌细胞SMMC-7721。通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光,估测转染效率,RT-PCR法检测转染细胞HMGA1mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果DNA测序证实,成功构建了特异性HMGA1siRNA真核表达载体,转染后72h,转染效率为40%左右。所构建的载体能够特异性沉默转染细胞HMGA1基因的表达。转染细胞HMGA1基因沉默后,细胞凋亡率(27·86%±2·44%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为2·82%±2·39%和2·04%±0·70%),G0-G1期细胞百分数(77·73%±1·78%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为42·19%±3·28%和39·23%±3·63%),G2-S期细胞百分数(22·27%±1·78%)明显低于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为57·81%±3·28%和60·77%±3·63%)。结论成功构建了HMGA1的RNA干扰真核表达载体。

摘要：目的研究C型CpG单链寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用。方法利用体外淋巴细胞增生实验和病毒保护实验确定新C型CpG ODN,采用小鼠体内抑瘤实验观察CpG ODN对肿瘤疫苗HSP65-MUC1重组蛋白抑制MUC1阳性肿瘤生长的增强作用,并对小鼠血清中抗HSP65-MUC1抗体的类型进行了初步鉴定。结果自行设计的CpG ODN BW005能刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生,其刺激后的培养上清具有保护Vero E6细胞免受VSV感染的作用,属于新型C型CpG ODN。将BW005与HSP65-MUC1联合应用于C57BL/6小鼠后,MUC1阳性肿瘤的发生明显延缓(平均44.8d),其终末肿瘤发生率最低(33.33%);荷瘤小鼠的生存期明显延长(平均49.5d),其终末生存率最高(66.67%)。小鼠血清中抗HSP65和抗MUC1的IgG2a抗体水平增加。结论C型CpG ODN可以增强肿瘤疫苗HSP65-MUC1的抑瘤效果,考虑与小鼠体内Th1环境的形成有关。

摘要：目的：通过检测小鼠脾细胞上清抗病毒活性,建立一种体外筛选小鼠敏感的新型抑制性寡聚脱氧核苷酸（ODN）的方法,为后续小鼠体内实验提供抑制性ODN的体外筛选方法。方法：将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组,收集不同浓度（0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00及32.00 mg.L-1）的CpG 2216刺激上清及CpG 2216作用小鼠脾细胞不同时间（3、6、12、24、48、72及96 h）的刺激上清,通过VSV病毒保护实验检测的A578评价各组上清的抗病毒活性,确定CpG 2216的最佳作用浓度、作用时间及刺激上清稀释度;再将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216＋抑制性ODN（A151）组,同上确定A151的最佳作用浓度;将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216＋抑制性ODN（MAT0106）组,应用上述优化的实验条件如各ODN剂量、作用时间等处理细胞后,收集刺激上清,采用VSV病毒保护实验,观察各抑制性ODN的抑制作用,以初步判定此方法的可行性。结果：筛选方法确定为：浓度为5×10^6·mL^-1的小鼠脾细胞铺于96孔圆底细胞培养板,加入CpG 2216至终浓度2 mg·L^-1和/或抑制性ODN至终浓度16 mg·L^-1,孵箱中培养24 h后收集上清,1∶4稀释上清后加入已贴壁的L929细胞板内,共孵育18 h后弃上清,加入VSV病毒液继续培养48 h。弃净上清后结晶紫染色、脱色并检测A578。此种筛选方法可以区别本室自行设计的抑制性ODN之间的抑制活性。结论：成功建立了抑制性ODN抑制小鼠脾细胞抗病毒活性的筛选方法,抑制性ODN的小鼠体外筛选方法的建立,为后续抑制性ODN在小鼠体内的生物学活性观察提供了体外筛选平台。

摘要：目的:研究人工合成的寡聚脱氧核苷酸(ODN)对人体抗病毒免疫反应的抑制作用,为开发具有免疫调节功能的新型ODN提供筛选平台。方法:将热灭活的人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和流感病毒PR8株(PR8-Flu)作为刺激物,同时以已知的免疫抑制性ODNIRS954作为抑制物,用生物学检测方法分析病毒与ODN共同作用的人外周血单个核细胞(PBMC)培养上清的抗病毒活性,并优化各项实验条件。结果:IRS954能显著抑制HSV-1和PR8-Flu诱导的人PBMC的抗病毒活性。在该实验条件下,自行设计的ODN显示出不同的免疫抑制活性。结论:具有一定序列特点的ODN能够抑制由DNA或RNA病毒诱导的人体抗病毒免疫,该实验方法为研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

摘要：目的:探讨免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)设计原则和筛选方法,为研究和开发新型免疫调节性ODN提供参考。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(hPBMC)作为研究对象,以3H-TdR掺入法检测CpG ODN诱导的细胞增殖水平,对自行设计的ODN的免疫调节活性进行筛选分析。结果:通过对两批免疫调节性ODN的设计和筛选,得到具有较强免疫抑制活性的ODN 667B,与CpG BW006组相比,其抑制率达到66.3%(P<0.01),并具有浓度相关性。结论:总结出免疫调节性ODN的设计原则,同时证明筛选方法可以用于免疫调节性ODN的筛选,为进一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

摘要：目的寻找能增强乙肝疫苗刺激IgG2a类抗体产生,使机体处于Th1样免疫环境的新型乙肝疫苗佐剂。方法选用自行设计的A、B、C型CpGODN,并以发表的A、B型CpGODN作为阳性对照,与重组乙肝疫苗混合后于第0、4周免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠血清中HBsAb水平及种类。结果各型CpGODN都能增强乙肝疫苗刺激HBsAb的产生水平,CpGODN+乙肝疫苗免疫的小鼠血清中HBsAb类型为IgG2a>>IgG1,而单独应用商品化重组乙型肝炎疫苗的小鼠血清中HBsAb类型为IgG1>>IgG2a。结论各型CpGODN对重组乙型肝炎疫苗[含Al(OH)3佐剂]均具有增效作用,而且可以诱导机体产生倾向于Th1途径的免疫应答反应。

摘要：目的:测定慢性肝炎患者体内输血传播病毒(TTV)样微小病毒(TLMV)的全基因序列,并研究人群中TLMV感染状况。方法:采用日本学者Shunji Mishiro提供的序列选择TLMV-CBD279和CBD-231最保守区设计引物,用慢性乙型肝炎且TTV阳性患者血清制备DNA模板,进行PCR扩增;将阳性PCR产物连接至pGEMR-T质粒,碱裂解法提取质粒DNA并纯化。以T7引物为起始全自动荧光测序仪测序。结果:获得162bp基因序列,该序列与日本株CBD231、CBD279同源性为72%,丙型肝炎患者及健康献血员感染率最高。结论:在中国慢性乙型肝炎患者体内存在TLMV感染。

摘要：根据多个物种的成纤维细胞生长因子10的序列,设计了特异的引物,从吉林双阳梅花鹿子宫cDNA文库中得到了梅花鹿成纤维细胞生长因子10,并应用多种数据库和软件对其进行了分析.

摘要：背景:研究表明柯萨奇B4病毒感染与1型糖尿病发病有关,但目前尚未明确其关系的确切机制。目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒,转入大肠杆菌中表达,并对表达产物进行功能鉴定。设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/08在吉林大学免疫学教研室完成。材料:CVB4、HeLa细胞病毒均为吉林大学病原生物教研室保存;菌株*** DH5α与M15为东北师范大学遗传所保存;质粒PUCm-T载体、PQE4.0载体由东北师范大学曾宪录教授惠赠。方法:提取柯萨奇B4病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增非结构蛋白P2C基因,与PUCm-T载体连接,将PUCm-T-P2C质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切,回收目的片断并定向克隆到PQE4.0表达载体中酶切鉴定。将PQE4.0-P2C阳性重组质粒转化大肠杆菌M15,在IPTG诱导下表达。主要观察指标:①以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C的表达。②采用淋巴细胞转化实验和酶联免疫吸附实验检测大肠杆菌M15细胞重组蛋白粗提物。结果:①反转录-聚合酶链反应扩增得到的987bp的cDNA片段,克隆入PUCm-T载体,酶切释放出长度约2773bp和987bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,序列分析与Genbank报道的序列一致。目的片段克隆入PQE4.0载体,酶切释放出长度约3400bp和987bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,获得PQE4.0-P2C重组表达质粒。②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示未诱导组无明显蛋白带,而诱导组在31000位置均出现较明显的蛋白带,且随着诱导时间延长蛋白表达量也随之增加。③淋巴细胞转化实验与酶联接免疫吸附试验测定结果表明,表达产物具有良好的抗原性与特异性。结论:柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C在大肠杆菌中高效表达,且表达产物具有一定的免疫活性。