摘要：目的:建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157 : H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法:设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针,确定网状分枝扩增方法(RAM)的灵敏度;含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46 : H38、 O22:H8、O111:NM,用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株,并进一步对瞬时RAM进行研究。结果:RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株,表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性,而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中,28株细菌含有stx2基因,其余则为阴性,与PCR检测结果100％一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌,检测信号的出现依赖于样品的浓度。结论:RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157:H7和STEC。

摘要：目的:探讨影响真菌微卫星聚合酶链反应(SSR-PCR)的多个因素,建立PCR的最佳反应体系,为进一步进行真菌的鉴定、遗传多样性研究奠定基础。方法:利用正交设计,从Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4种因素,对真菌微卫星反应体系进行优化分析,并确定PCR适宜的退火温度及循环次数。结果:各因素的不同水平对PCR结果都有显著影响,其中模板DNA影响最大。在PCR反应体系中(25μL),Taq DNA聚合酶1U,模板DNA 30 ng,dNTP 150μmol.L-1,引物0.25μmol.L-1为最佳。结论:采用正交法实验设计,对真菌微卫星PCR体系优化更科学,得出的实验体系有效范围宽,且高效、快捷。

摘要：目的建立一种快速、准确的鉴定无菌性脑膜炎患者肠道病毒感染的方法。并与传统的细胞培养及血清分型相比较。方法对78例无菌性脑膜炎患儿脑脊液中肠道病毒,用人宫颈癌细胞(HeLa)、横纹肌细胞(RD)和人喉癌细胞(Hep-2)细胞进行分离培养血清分型,同时用根据肠道病毒5’UTR区基因序列设计引物,用PCRT-R法扩增病毒的基因。结果该方法可检测的灵敏度的组织培养感染量(TCID50)为0.1;78例脑脊液(CSF)中46例肠道病毒培养为阳性,而用RT-PCR法检测52例阳性。结论该方法与细胞培养及肠道病毒血清分型法相比较具有较高的灵敏度和特异性,可快速、灵敏地检测脑脊液中的肠道病毒。

摘要：目的:克隆幽门螺杆菌(Hp) hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构。方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性。原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni^(2+)亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件。结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300。HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白。HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为6.87%,无规则卷曲为38.63%。抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的5个优势线性表位和3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位。同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕。HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在0.2 mol·L^(-1)氯化镁、 0.1 mol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L^(-1)己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体。结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础。

摘要：目的:探讨血栓性疾病(TD)个体化用药指导基因芯片的制备过程,阐明一种快速、高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的方法。方法:根据氯吡格雷药物代谢基因位点(CYP3A4、CYP2C19*17、CYP2C19*2和CYP2C19*3)和华法林药物代谢基因位点(CYP4F2*3、GGCX、VKORC1-2、VKORC1-1、CYP2C9*2和CYP2C9*3)设计相应的探针和引物,制备TD个体化用药指导的基因芯片检测试剂盒。经过DNA提取、PCR扩增、杂交、洗脱和扫描等步骤对基因芯片的灵敏性、重复性和稳定性进行评价。收集3个地区的150例TD受试者样本并进行药物代谢基因检测,以受试者在临床中接受的用药指导及6个月后患者的疾病恢复情况为依据,评价基因芯片试剂盒的有效率。结果:基因芯片检测2种药物的代谢基因均出现良好的杂交信号;芯片检测PCR扩增产物的最低检测浓度为103 copies·mL-1;对不同批次的3张芯片及同一批次的10张芯片进行平行测定,符合率为100%;芯片具有稳定性,有效期长达6个月;来源于3个地区的150例TD样本验证基因芯片检测试剂盒的有效率在90%以上。结论:成功制备了高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的TD个体化用药指导基因芯片试剂盒,该方法灵敏度高,重复性好,稳定性强,制备效果优良。

摘要：目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )基因真核表达质粒。方法 :根据 GRA1基因已知序列 ,设计一对引物。用 PCR技术从弓形虫 RH株基因组 DNA中扩增 GRA1基因片段 ,插入 pc DNA3质粒 ,转化大肠杆菌 DH5 α感受态细胞 ,经酶切及 PCR鉴定、测序。结果 :从弓形虫 RH株基因组中扩增出 775 bp的 GRA1基因 ,测序显示该基因存在一 1 35 bp的插入序列 ,使得所得 PCR产物分子量大于预期值 (6 2 8bp)。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论 :首次报道了变异的弓形虫 RH株

摘要：目的探讨冠状病毒基因芯片的研制方法,建立一种快速定性检测人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道感染样本中的7种冠状病毒和2种流感病毒核酸的方法。方法根据互联网公布的10种呼吸道感染病毒的基因序列,设计了相应的引物和探针序列,经琼脂糖凝胶电泳筛选验证后,将探针点样于醛基修饰基片,完成了检测芯片制作。结果将聚合酶链式反应扩增产物用10倍梯度稀释法稀释后进行基因芯片检测,结果表明可形成杂交斑点的最低检测浓度为103copies/mL。结论研制的冠状病毒基因芯片具有良好的特异度和灵敏度,可同时对SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒同时进行高通量快速检测。

摘要：目的建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法。方法对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性。结果该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测,未发现有交叉反应。结论已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法。

摘要：目的:根据构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因特异位点设计并合成Taqman探针及引物,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法。方法:应用lasergene7.1软件对构巢曲霉与13种常见曲霉主要包括黑曲霉(***)、烟曲霉(***)、杂色曲霉(***)、土曲霉(***)、黄曲霉(***)、温特曲霉(***)、寄生曲霉(***)、泡盛曲霉(***)、米曲霉(***)、棒曲霉(***)、赤曲霉(***)、亮白曲霉(***)及赭曲霉(***)进行GAPDH基因序列比对分析,在特异位点设计引物和探针,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性及敏感性分析。结果:用曲霉属22种41株不同曲霉及其他属的12株病原真菌验证实验表明,所建立的荧光PCR方法特异性强;检测灵敏度可达4.03×10-12μg/ml的模板DNA。结论:应用实时荧光PCR技术能够有效检测构巢曲霉,该方法具有特异、灵敏、快速等特点,可在实际工作中应用。

摘要：目的:根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法。方法:通过对多种病原曲霉Mto1基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证。结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08×10-6μg/ml的模板DNA。结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题。