摘要：目的:构建食物中毒菌多联融合毒素基因并分析其是否保持了原来毒素基因的抗原特性。方法:采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌5个毒素基因片段进行串联,构建重组融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB(命名为F5)基因,应用DNAstar,对F5融合蛋白抗原特性等进行预测分析。结果:构建的融合毒素F5保留了5种毒素的抗原特性,基因全长序列2 937 bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,测序结果与设计序列(GeneBank)100%同源。结论:成功构建了食物中毒菌多联融合毒素F5基因,为下一步研究融合毒素F5的表达及利用融合毒素检测食物中毒菌毒素建立广谱免疫学检测新方法奠定了基础。

摘要：采用柔性Linker序列(Gly4Ser)对目的基因进行串联(FlaA-FlaF-FlaB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在***21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫獭兔制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在***21中得到表达,表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量23.5%),基因序列全长3420bp,编码1140个氨基酸,蛋白相对分子质量为119000,测序结果与设计序列一致性为99%。ELISA和琼脂扩散试验表明,融合鞭毛F3与其他几种中毒性弧菌鞭毛具有一定的免疫交叉性,与多种非目标菌不发生反应。从而表明,多联融合鞭毛基因的表达质粒已构建成功并制备了抗血清,为利用融合鞭毛的方法检测食物中毒性弧菌,进而建立食物中毒性弧菌广谱、快速的检测方法奠定了基础。

摘要：[目的]研究大腹园蛛组织蛋白酶B相关基因Avg 1(基因登录号:AY302573)编码蛋白的生物学特性.[方法]设计合成引物(AvgS,AvgX),扩增Avg 1,去除信号肽部分基因Avg,将其与原核表达载体pET-28a(+),pET-20b连接,转化到***21(DE3)中.[结果]鉴定为阳性克隆后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示Avg-28a-DE3在近35.7ku处出现明显的表达带,其大小与预计分子质量(35.2ku)相当;经薄层扫描分析显示,表达蛋白量占菌体蛋白总量的39.6%,且表达形式主要为包涵体,而Avg-20b-DE3表达产物未见表达带,但RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录;将表达的包涵体蛋白进行变性及复性处理,与诱导的Avg-20b-DE3表达菌经超声波碎菌处理上清液一同进行蛋白酶活性测定,呈复性的包涵体蛋白不具有酶活性,而Avg-20b-DE3的碎菌上清液显示明显的蛋白酶活性.表达的包涵体蛋白经电洗脱纯化后,常规方法免疫吉绒獭兔,抗血清经ELISA法检测,呈明显阳性反应,经Western blot检测在35.7ku处出现特异结合带.[结论]Avg 1原核表达蛋白具有良好的免疫原性.