摘要：目的:制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidae)酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法:以pSV-β-galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果:获得与pSV-β-galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14000及116000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论:成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。

摘要：目的:研究体外转录合成的siRNA对Hela细胞中VEGF表达的干涉作用。方法:根据人VEGF1～5外显子序列进行siRNA设计,应用T7RNA聚合酶体外转录合成3条siRNA。并利用siPORTLipid将siRNA转染入Hela细胞中,通过半定量RTPCR和免疫荧光方法检测Hela细胞VEGF表达情况,评价不同序列siRNA对VEGF基因表达的干涉作用。结果:体外转录合成的3条siRNA均能高效地抑制Hela细胞中VEGF的表达,干涉效率分别为88.7%、94.2%和80.3%,而1个错配碱基的siRNA及ssRNA(+)未显现明显干涉作用。另外实验显示在5～10pmol范围内,T7siRNA对VEGF表达的抑制作用具有剂量依赖性。结论:利用T7RNA聚合酶体外转录合成的siRNA可以高效干涉Hela细胞中VEGF的表达且具有良好的序列特异性,为肿瘤的基因治疗提供了新方法。

摘要：目的克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1-EPNP,将重组质粒转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆。方法根据Gen-bank中大肠杆菌PNP基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向插入pMD-18T克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染MKN-45细胞。结果PCR扩增出716bp大小的片段,测序结果与已报道的EPNP基因序列一致;亚克隆经酶切鉴定正确;RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因MKN-45细胞克隆中存在大量EPNPmRNA,前体药MePdR对转染EPNP的MKN-45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。

摘要：目的构建针对胰岛素生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对人U251脑胶质瘤细胞株中IGFBP-2表达的抑制作用。方法根据GenBank提供的IGFBP-2基因(NM-000597)核苷酸序列及siRNA的设计原则,设计合成4对带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,筛选得到576~594 nt、908~926 nt、938~956 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列,应用限制性内切酶酶切和测序技术鉴定重组克隆。用脂质体介导转染人U251胶质瘤细胞株,采用RT-PCR和Western印迹方法检测细胞IGFBP-2 mRNA和蛋白表达。结果酶切筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR和Western印迹检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低U251细胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建载体介导的IGFBP-2靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制U251细胞中IGFBP-2基因的表达。

摘要：目的构建MAGE-1与IL-18共表达质粒pcIL-18-MAGE并进行体外验证表达。方法设计合成MAGE-1与IL-18引物,PCR扩增其基因片段,分别构建以pcDNA3为载体的小鼠IL-18重组质粒和人MAGE-1重组质粒,pcCMV-IL-18与MAGE-1的PCR产物酶切连接构建共表达质粒pcIL-18-MAGE。脂质体法将构建的重组质粒转染293细胞,RT-PCR和Western印迹法验证MAGE-1和IL-18在转化细胞中的表达。结果成功获得共表达质粒pcIL-18-MAGE,RT-PCR可见目的条带,Western印迹显示转染MAGE-1与IL-18的细胞在蛋白质水平上均有表达。结论成功地构建出既表达mIL-18又表达MAGE-1的共表达质粒pcIL-18-MAGE。

摘要：目的：为了制备高纯度、高活性的重组人白细胞介素与。方法：化学诱导重组表达载体pT7．7hIL-6进行蛋白表达，菌体经超声破碎分离包涵体，并对包涵体进行洗涤、变性和复性处理，用DEAE-Sepharose CL-6B弱阴离子交换柱一步纯化复性的重组人IL-6。采用3H-TdR法测定rh-IL-6的活性。结果：表达产物经纯化后纯度达95％，比活性为3．0x10^8U/mg。结论：本实验设计的纯化工艺简便易行，所得产品纯度度、产率高。

摘要：目的:探讨高电压脉冲电场诱导红白血病细胞K562和淋巴细胞凋亡的最佳参数。方法:调节电场强度和脉冲频率分别作用K562细胞和淋巴细胞后,用Annexin V/PIKit标记凋亡细胞,流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;设计正交试验确定电场诱导K562细胞凋亡的最优参数组合;电场作用K562细胞与淋巴细胞(1∶1)混合悬液进行选择性诱导凋亡;MTT法检测电场作用后的K562细胞与淋巴细胞的增殖。结果:K562细胞的凋亡率随着脉冲频率的增加而升高,当脉冲频率为30Hz时,凋亡率高达79.13%;K562细胞和淋巴细胞的凋亡率均随着电场强度的增加而升高,在电场强度达到30kV/cm时,二者的凋亡率分别达82.40%、57.08%。诱导K562细胞凋亡的最优参数组合为脉冲宽度1μs、电场场强25kV/cm、脉冲个数为12个。K562细胞与淋巴细胞混合液在电场作用下发生凋亡的细胞百分比具有显著性差异(P<0.05);K562细胞与淋巴细胞经相同条件的电场作用后,二者生存率比较,差异显著(P<0.05)。结论:利用高电压脉冲电场使癌细胞选择性失活是可行的。

摘要：目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12p35与p40基因片段。利用KpnⅠ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用KpnⅠ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果:通过PCR分别获得约1000bp大小的p40基因片段与600bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1600bp左右的拼接产物,采用KpnI内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1000和600bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1600bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。

摘要：目的 :构建 IFN- β信号肽序列与白细胞介素 18(IL- 18)成熟肽的重组嵌合分子。方法 :从 BAL B/ c鼠基因组 DNA扩增 IFN- β信号肽序列 ;由小鼠 Pro- IL- 18真核表达质粒获得 IL- 18成熟肽序列 ;以非对称 PCR技术得到IFN- β信号肽编码区的反义链和 IL- 18成熟肽正链 ;采用重叠延伸 PCR(SOE- PCR)产生具有 IFN- β信号肽与 IL- 18成熟肽的嵌合编码序列 ;定向连方式构建嵌合 IL- 18的表达质粒并测序。结果 :连续胶 PAGE表明非对称 PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链 ,大小符合预期。IFN- β信号肽对称 PCR产物与 IL- 18非对称 PCR产物混合作为模板 ,进行重叠延伸 ;电泳分析可见清晰的嵌合片段 ;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成 ,且无移码。结论 :重叠延伸 PCR是一种获得重构基因的简捷方法。

摘要：目的:探讨先天性多拇畸形的治疗方法。方法:对35例先天性多拇畸形的患者进行手术,通过皮肤切口的设计、骨骼支架的建立、关节的修复、拇外展功能的重建等方面的治疗。结果:35例患者术后进行3个月至2年的随访,拇指的外形及功能均取得满意的效果。结论:先天性多拇畸形临床治疗需选择适当手术时机,从切口设计、骨骼支架的建立、关节的修复、拇外展功能的重建等方面综合考虑才能取得较好的疗效。