摘要：目的:根据构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因特异位点设计并合成Taqman探针及引物,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法。方法:应用lasergene7.1软件对构巢曲霉与13种常见曲霉主要包括黑曲霉(***)、烟曲霉(***)、杂色曲霉(***)、土曲霉(***)、黄曲霉(***)、温特曲霉(***)、寄生曲霉(***)、泡盛曲霉(***)、米曲霉(***)、棒曲霉(***)、赤曲霉(***)、亮白曲霉(***)及赭曲霉(***)进行GAPDH基因序列比对分析,在特异位点设计引物和探针,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性及敏感性分析。结果:用曲霉属22种41株不同曲霉及其他属的12株病原真菌验证实验表明,所建立的荧光PCR方法特异性强;检测灵敏度可达4.03×10-12μg/ml的模板DNA。结论:应用实时荧光PCR技术能够有效检测构巢曲霉,该方法具有特异、灵敏、快速等特点,可在实际工作中应用。

摘要：目的建立一种快捷、灵敏、特异的Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)实时荧光定量PCR检测体系。方法设计HSV-2糖蛋白E基因特异性引物,PCR扩增gE基因片段,并与pGEM-T-easy载体连接,构建pGEM-T-easy-gE2重组质粒。以连续10倍稀释的浓度梯度制备PCR体系标准品质粒,应用SYBR Green法建立gE2real-time PCR方法并优化引物浓度、Mg2+浓度、退火温度和循环程序等条件,绘制标准曲线,并验证方法的敏感性、特异性和稳定性;用该方法检测HSV-2感染小鼠生殖道拭子标本。结果 gE2real-time PCR的标准品线性关系良好(r2=0.997),其他妇科常见病原体无特异扩增;方法的最低检测质粒浓度为3.85×101 copy/μl,试验的变异系数<1%,检测30份小鼠HSV-2感染生殖道拭子标本的阳性率为96.7%,高于常规PCR方法(80.0%)。结论gE2real-time PCR法检测HSV-2具有灵敏、特异、重复性好,可用于HSV-2定性分析和病毒载量检测。