摘要：为建立绵羊鹦鹉热衣原体(Cp)间接ELISA抗体检测方法,本实验将编码Cp主要外膜蛋白MOMP的omp A基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后,合成质粒p ET-28b(+)-omp A,另外设计特异性引物,分别将omp A截短克隆至p ET-28b(+)载体中构建重组表达质粒p ET-28b(+)-omp A_(1-182)和p ET-28b(+)-omp A_(183-390),测序鉴定正确后分别转化至*** BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导并纯化后,经western blot鉴定3个重组蛋白,结果显示,重组MOMP_(183-390)蛋白(r MOMP_(183-390))表达效果最好。以r MOMP_(183-390)作为包被抗原,采用方阵滴定法优化各反应条件,初步建立了检测Cp抗体的间接ELISA方法。采用建立的该方法检测羊痘病毒、布鲁氏菌、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒等羊临床常见病的阳性羊血清,结果显示,除Cp外,该方法与其他阳性羊血清均无交叉反应,特异性强;将Cp阳性血清2倍倍比稀释(1∶50~1∶6400)后采用该方法检测,结果显示,当Cp阳性血清稀释达1∶1600时,仍可检测到抗体,敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均小于10%。采用本研究建立的ELISA方法,以及间接血凝(IHA)试验和western blot分别检测随机选取的120份临床羊血清,结果显示该方法与IHA、western blot的总符合率分别为85%和91.67%;进一步采用建立的间接ELISA方法检测381份吉林省5家羊场的绵羊血清样品,结果显示阳性率为22.83%(87/381)。本研究建立的绵羊Cp omp A重组截短蛋白的间接ELISA抗体检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为Cp临床样品检测及流行病学调查提供了可靠的技术手段。

摘要：为了克服传统养殖模式饲养效率不高的问题,笔者为陕西省富平县1个3000只奶山羊养殖场进行了规划设计,场址选择严格遵循《畜禽养殖污染防治管理办法》规定,符合该地区土地利用发展规划要求、行业标准和国家标准,即距离城镇居民区、集贸市场、学校、饮用水源、交通主干道等场所1000 m以上,距离其他畜禽场、屠宰加工场、无害化处理中心3000 m以上,本着地势平坦、高燥,水、电、饲草资源充足,交通便利的原则进行选址;该奶山羊养殖场场区主要包括生活管理区、生产区及粪污处理区3个部分。生活管理区位于场区上风向处的出入口位置,设有消毒池、职工宿舍、餐厅、办公室等;生产区是羊场的核心,主要有消毒室、9栋羊舍(1栋种公羊舍、1栋妊娠羊舍、1栋羔羊舍、1栋育成羊舍、5栋泌乳羊舍)、挤奶厅、饲料加工区、药浴池、兽医室,羊舍采用双列式布局方式;粪污处理区位于羊场的下风向,包括无害化处理区、粪污处理区和隔离室。羊舍采用坐北朝南方向的双坡半开放式暖棚,墙体采用普通黏土砖堆砌,暖棚坡面采用热镀锌钢管以琴弦式骨架结构支撑,覆盖聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)涂塑帆布、毛毡;羊舍内设有双排对称的14个圈舍,每排7个,每个圈舍配有面积是圈舍1.5倍的运动场;羊舍内采用硬质塑料漏缝地板,配有刮粪装置,统一收集粪便运送至粪污处理区进行生物热发酵;羊舍内安装鱼眼全景网络摄像机,运动场安装日夜型半球型网络摄像机,实现羊只盘点和异常情况监测;羊舍内安装风机以便于通风换气;羊场配有转盘式挤奶机,每个站位上的控制器能够实时监测羊只的挤奶状态,及时发现挤奶过程中的异常情况,保证羊奶的产量和质量。说明合理的规划设计和完善的配套设施是羊场实现各养殖环节标准化、及时分析生产数据、遵循科学的饲养管理流程的基础,进而可提高养殖场的经济效益。

摘要：为克隆绵羊角细胞关联蛋白2(Keratinocyte-associated protein 2,KRTCAP2)基因mRNA并分析该基因表达分布规律,本研究首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KCTCAP2基因并进行两个品种间的比较分析,随后利用HRM方法对目的SNP位点进行基因多态性分析,最后用q RT-PCR方法分析两个品种不同组织间KRTCAP2基因的时空表达分布。RT-PCR扩增显示绵羊皮肤组织出现略小于500 bp的特异性条带,测序证实该片段为KRTCAP2基因,长度为466 bp,编码149个氨基酸。所克隆的4条片段中存在4个SNP位点,其中2个SNP位点引起氨基酸位点突变。针对c.194位A>G突变位点设计的HRM检测发现小尾寒羊、新吉细毛羊等群体中并不存在该多态位点。小尾寒羊与新吉细毛羊不同组织间的表达分布显示,KRTCAP2基因存在多组织表达特性,在两品种羊组织表达模式既存在一致性也存在差异性。一致性主要表现为小尾寒羊与新吉细毛羊中肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道与皮肤组织中KRTCP2表达量较心脏组织呈现上调表达的趋势。差异性表现为新吉细毛羊在肝脏、脾脏、肺脏、肠道、脑和皮肤的组织表达量均高于小尾寒羊,在肌肉和卵巢组织中的表达量低于小尾寒羊,在肾脏组织中的表达量基本持平。本研究成功克隆出绵羊KRTCAP2基因并进行了系统分析,为探讨绵羊角细胞功能奠定了基础。

摘要：本试验旨在研究黄粉虫对冬毛期水貂体重变化、营养物质消化率、氮代谢及毛皮质量的影响。采用单因子试验设计，选取125日龄健康雄性水貂60只，随机分成5组。Ⅰ组饲喂基础饲粮（不含黄粉虫）；Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组水貂的饲粮中分别添加2％、4％、8％和16％的黄粉虫。预试期7 d，试验期80 d。结果表明：1）2013-11-17时，Ⅳ组和Ⅴ组水貂的体重显著高于Ⅲ组（P＜0．05）；各组平均日增重差异不显著（P＞0．05）。2）Ⅳ组水貂的采食量极显著高于Ⅰ组和Ⅱ组（ P＜0．01）；Ⅱ组和Ⅴ组水貂粗蛋白质消化率极显著高于Ⅳ组（ P＜0．01）；各组粗脂肪消化率和粗灰分消化率差异不显著（ P＞0．05）。3）Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组水貂的食入氮显著高于Ⅰ组和Ⅱ组（P＜0．05）；Ⅲ组、Ⅳ组水貂的粪氮极显著高于Ⅰ组和Ⅱ组（P＜0．01）；Ⅴ组水貂的尿氮极显著高于Ⅱ组和Ⅳ组（ P＜0．01），Ⅳ组水貂的氮沉积、净蛋白质利用率和蛋白质生物学价值显著高于Ⅰ组（P＜0．05）。4）Ⅴ组水貂的皮长显著高于Ⅰ组（P＜0．05）；Ⅴ组水貂的鲜皮重显著高于Ⅲ组（ P＜0．05）；Ⅲ组水貂的针毛长显著高于Ⅳ组（ P＜0．05）。由此可见，饲粮中添加黄粉虫能够减少鱼粉、肉骨粉和豆油的添加量，饲粮中添加8％～16％的黄粉虫能够改善毛皮质量。

摘要：为了建立绵羊FecB基因高通量检测HRM方法并对其准确性进行检验,实验首先采用基因组PCR产物直接测序法,分别筛选出BB、B+和++基因型基因组各2份,参照HRM原理分别设计检验引物H1和H2并进行系统检验分析。分析结果发现,使用H1引物扩增效率及特异性良好,但不能分辨BB基因型,而使用H2引物扩增效率及特异性良好,且能够有效识别3种基因型。扩大检验群体发现,使用H2引物的HRM技术重复性良好。以基因组PCR产物直接测序结果为参考标准,检验HRM方法的准确性发现BB基因型检验敏感度为75%,B+和++基因型敏感性分别为96.2%和100%,总体准确率为96.9%,证实该方法能够满足育种实践对检测技术准确性的要求。绵羊FecB基因HRM检验方法的建立为高繁殖性状肉羊育种提供了新的技术工具。

摘要：干扰素刺激基因在抗病毒及调节IFN信号通路的过程中具有重要作用。本课题组前期对犬瘟热病毒(CDV)感染宿主前后全转录组进行测序分析,发现干扰素刺激基因ISG15和IFIT2明显上调,为了进一步探究ISG15和IFIT2对CDV感染的影响,本研究设计合成了犬源ISG15、IFIT2和持家基因GAPDH的特异性引物,分别进行PCR扩增,构建质粒标准品,建立荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。结果表明,犬源ISG15、IFIT2和GAPDH的荧光定量PCR标准曲线的相关性R^2均大于0.98,表明线性关系良好。ISG15、IFIT2和GAPDH的融解曲线均为单峰,扩增产物单一,且峰值一致,表明建立的荧光定量PCR方法特异性良好。组内与组间的变异系数均小于0.2%,表明该方法重复性较好。对CDV感染宿主细胞前后的ISG15和IFIT2 mRNA表达水平进行检测,发现CDV感染后ISG15和IFIT2的表达量升高,表明ISG15和IFIT2在CDV感染过程中发挥重要作用。该结果为针对CDV与干扰素抗病毒研究的开展提供重要的技术手段,并为进一步揭示CDV致病的分子机制奠定基础。

摘要：为了筛选到有效干扰牛叉头框M1(forkhead box M1,FOXM1)基因特异性siRNA,试验设计并合成3个靶向干扰牛FOXM1的5-羧基荧光素(FAM)标记siRNA,对siRNA转染剂量进行优化,筛选出干扰效果较好的siRNA,并检测干扰FOXM1后MDBK细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达水平。结果表明:siRNA的最佳转染剂量为1.5μL(20μmol/L),3个特异性siRNA的干扰效率分别为34.2%、52.0%及72.5%,干扰牛FOXM1基因效果最好的siRNA是siRNA-929,它能够阻止细胞中LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型的转化,使自噬过程受到抑制。说明试验成功筛选到干扰牛FOXM1基因的特异性siRNA。

摘要：为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。

摘要：我国养牛业已经发展到一个新的历史阶段，初步形成了肉牛产业体系的雏形，人均牛肉占有量约5kg，牛肉已经成为大中城市消费群体不可或缺的肉食品。品种是制约肉牛产业进一步发展的首要因子，由于我国肉牛业的基础薄弱，加之肉牛自身的生物学特性和现有落后的生产组织形式，使肉牛育种工作极其艰难。为此，在新的历史时期，肉牛育种必须采取更加有效的组织形式——联合育种。

摘要：本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性PCR方法。通过对纯化后IBV核蛋白基因进行的直接PCR及套式PCR扩增表明 ,两次PCR产物的大小为 0 .7kb和 0 .5kb ,与实际设计相符。而对照的NDV及IBDV的PCR扩增产物均为阴性。用IBVHB(华北 )株感染SPF鸡后 ,应用我们所建立的PCR方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的IBV ,在SPF鸡感染IBV后的 2 1天仍然能够检测到IBV的基因组 ,Southernblot杂交试验证明了我们获得的PCR产物为IBV的核蛋白基因。对 30份自然感染病料的检测表明 ,本实验所建立的PCR方法检测阳性数为 15份 ,阳性率为 5 0 % (15 /30 ) ;鸡胚接种检测的阳性数为 17份 ,阳性率为 5 6 .7% (17/30 ) ;IFA检测的阳性数为 11份 ,阳性率为 36 .7% (11/30 )。PVR检测法与鸡胚接种方法的阳性符合率为 93.3% (14/15 ) ,统计学分析表明 ,P >0 .0 5 ,差异不显著 ,而PCR检测法与IFA的阳性符合率为 6 0 % (9/15 )。结果证明本实验所建立的PCR检测方法具有敏感、特异、快速等特点 。