摘要：目的 建立单核细胞化学吸引蛋白质1（MCP-1）小分子干扰RNA（siRNA）人肾小管上皮细胞株，并检测MCP-1 siRNA对人肾小管上皮细胞（HKC）MCP-1基因的抑制效应。方法 针对人MCP-1mRNA67、116、142位点设计并合成3对MCP-1siRNA序列。构建MCP-1特异性siRNA真核表达载体，以脂质体法瞬时转染至HKC。转染24h后分别应用实时定量RT-PCR及Western印迹技术检测HKC内MCP-1mRNA、蛋白表达，筛选出抑制效率最高的MCP-1siRNA。以筛选出的MCP-1siRNA序列构建慢病毒穿梭质粒。使用慢病毒穿梭质粒进行慢病毒颗粒的包装和生产，得到病毒液并确定其滴度。以病毒液感染HKC，筛选MCP-1siRNA人肾小管上皮细胞株，并应用实时定量RT-PCR及Western印迹技术检测HKC内MCP-1mRNA、蛋白表达。结果 成功建立MCP-1特异性siRNA人肾小管上皮细胞株。MCP-1siRNA稳定转染能下调人肾小管上皮细胞MCP-1mRNA（68．49±6．38）％、蛋白（72．97±6.13）％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 MCP-1特异性siRNA能高效抑制HKC内MCP-1基因表达。MCP-1 siRNA人肾小管上皮细胞株的建立为MCP-1基因功能及肾间质纤维化防治研奔提供宴验材料和依据。

摘要：目的研究质粒表达型小分子干扰RNA(siRNA)对人肾小管上皮细胞(HKC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的抑制作用。方法2002年2～7月对同济大学附属东方医院针对人MCP-1 mRNA67、116、142位点设计并合成的3对MCP-1siRNA序列,构建MCP-1特异性siRNA真核表达载体pRNAT-MCP-1-Ⅰ、pRNAT-MCP-1-Ⅱ、pRNAT-MCP-1-Ⅲ,以脂质体法转染至HKC,转染24h后分别采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot技术检测HKC内MCP-1 mRNA、蛋白表达。结果siRNA表达载体的转染效率为60%,与正常对照组相比,3组不同质粒表达型siRNAMCP-1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结论siRNA能高效抑制HKC的MCP-1基因表达,提示siRNA在防治肾间质纤维化中具有潜在作用。

摘要：目的构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果。方法针对小鼠dynactin-1mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒。各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平。结果构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低。结论构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础。

摘要：目的建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子RNA(siRNA),抑制人肾小管上皮细胞(human kidneytubular epithelial cells,HKC)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1R)的表达。方法针对人AT1R mRNA135到156位点,由美国Ambion公司设计并合成AT1R siRNA序列,以脂质体法瞬时转染至HKC,利用RT-PCR及Western blot技术检测HKC内AT1R mRNA及蛋白表达。结果AT1R siRNA转染对人肾小管上皮细胞AT1R的抑制效果在48h达到最大抑制作用;转染后,HKC细胞AT1R mRNA表达下调(68.5±6.4)%,AT1R蛋白表达下调(80.7±5.3)%,与对照组比较存在显著性差异(P<0.001)。使用AngⅡ刺激,特异性AT1R siRNA转染组AT1R表达明显下降,无转染及非特异性转染组AT1R表达升高。特异性AT1R siRNA转染HKC细胞后,其炎症因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达明显下降。结论本研究利用脂质体瞬时转染siRNA方法,成功抑制肾小管上皮细胞表达AT1R,为后续相关研究提供实验方法。

摘要：目的 构建大鼠β防御素2（rBD2）基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR（RT-PCR）及Western免疫印迹测rBD-2 mRNA及蛋白表达,筛选沉默效果最佳的为LV-shrBD2载体.用慢病毒包装系统对LV-shrBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度.结果 凝胶电泳显示3个RNAi慢病毒重组载体的PCR产物为316 bp,测序结果表明序列正确.转染细胞后RT-PCR及Western免疫印迹检测,siRNA序列1构建的重组载体mRNA抑制率达82%,干扰效率最高,为所需的rBD2基因RNAi慢病毒载体LV-shrBD2.包装慢病毒颗粒并调整病毒滴度至1×105ifu/μl.结论 成功构建并筛选出沉默效应最佳的rBD2基因RNAi慢病毒表达载体LV-sh1rBD2,为进一步开展rBD2研究提供了依据.

摘要：背景:中药结合前列地尔等西药的中西医结合疗法在延缓急性肾损伤方面的作用已得到证实,但对慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)肾功能减退进展的疗效尚无定论。目的:探讨规律地使用活血化瘀中药丹参多酚酸盐联合前列地尔、谷胱甘肽等西药是否具有延缓CKD患者肾功能减退的长期疗效。设计、场所、对象和干预措施:所有患者均为2004年8月～2010年10月在第二军医大学长海医院住院的符合CKD临床诊断标准的患者,共30例,肾功能分期为CKD2～4期。采用随机、对照的试验设计方案,将30例患者分为试验组和对照组,每组15例。在常规治疗基础上,试验组每月1次静脉滴注丹参多酚酸盐、前列地尔、谷胱甘肽等中西药物治疗,每次7～10d,1个月后重复下一疗程;对照组则采取和试验组同样的口服药物治疗,但不用丹参多酚酸盐以及前列地尔和谷胱甘肽的保守疗法。随访时间平均4年。主要结局指标:研究终点为血肌酐值较入组时增长一倍或患者进入替代治疗阶段。观察治疗前后患者血常规、电解质、血白蛋白以及血肌酐的变化以及1～4年末每组患者的留存数。结果:4年后两组患者血白细胞计数、白蛋白及电解质水平无明显变化(P>0.05),试验组患者血红蛋白较对照组明显升高(P<0.01);试验组进入研究终点的患者比例(40%,6/15)显著低于对照组(93%,14/15;P<0.01)。结论:规律地使用丹参多酚酸盐联合前列地尔和还原性谷胱甘肽的中西医结合疗法可延缓CKD患者肾功能的恶化,阻止患者进入替代治疗阶段。

摘要：目的评价国产甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液治疗呼吸道感染和泌尿道感染的临床疗效和安全性。方法采用多中心随机、双盲、阳性药物平行对照设计。共入选244例，脱落4例。试验组120例，使用甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液，每次300mg，每日2次静脉滴注；对照组120例，使用盐酸左氧氟沙星葡萄糖注射液，每次200mg，每日2次静脉滴注；疗程均为7-14d。安全性评价244例。结果试验组和对照组呼吸道感染治疗的临床总有效率分别为77.0％和80．6％，泌尿道感染治疗的总有效率分别为93．5％和89．6％。试验组总细菌清除率为91．5％，其中呼吸道感染及泌尿道感染细菌清除率分别为89．6％和94．1％。对照组总细菌清除率为93．4％，其中呼吸道感染及泌尿道感染细菌清除率分别为97．3％和89．7％。试验组和对照组不良反应率分别为4．88％和7．44％，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论国产甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液治疗呼吸道感染和泌尿道感染安全、有效。

摘要：中医全科医学在教学方面已初现成果,而与之相关联的毕业后在社区医院和综合医院从事中医全科事业的医务人员应如何寻求所在学科的特色发展和个人职业生涯的长效发展等临床实践问题,还存在诸多困惑。上海中医药大学附属上海市中西医结合医院中医全科医学科作为上海市首批中医全科教学基地,已建科4年,在完成教学工作的同时,也积累了丰富的临床经验,并初步探索出一条极具特色的学科发展道路。本文通过整理分析其实践经验,总结出包括理论设计、临床实践、取得成效、问题不足、下一步发展方向等5个方面的内容,其中理论设计是以“SOAP问诊”和“六经辨证”为核心的中医全科规范化诊疗体系;临床实践则介绍了本研究所在单位临床服务流程和各个环节技术与服务操作内涵;取得成效主要从患者数量变化、患者地理位置分布变化、患者诊疗疗程变化3个方面展示服务逐步深入性和成长性;问题不足主要包括学科原始创新技术和学科理念传播2个方面;下一步发展将重点关注借助理论来加速实践探索,并寻找到3个理论模型重点突破影响力建设、原创性技术研发、医教研互动3个方面。