摘要：目的构建表达大鼠TLR4 shRNA的慢病毒,并观察其对大鼠肺泡巨噬细胞TLR4的抑制作用和对内毒素(LPS)诱导的IL-6、IL-1β释放的影响。方法设计并构建4个可能具有干扰效力的shRNA表达质粒,将他们分别与预先构建好的TLR4表达质粒共转染HEK-293T细胞,筛选出一段干扰效果最好的shRNA,使用Gateway的方法重组到慢病毒表达载体中并进行病毒包装和滴度测定,使用包装好的慢病毒感染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383并加入LPS刺激,ELISA检测IL-1β、IL-6的释放情况。结果成功筛选出具有较高干扰效率的shRNA,并成功包装入慢病毒,慢病毒滴度为2.0×106TU/ml。转染慢病毒后的LPS诱导的肺泡巨噬细胞IL-1β、IL-6的释放均明显减少(P<0.05)。结论成功构建了表达大鼠TLR4 shRNA的慢病毒,具有良好的抑制IL-1β、IL-6表达的作用,为下一步动物体内实验基因治疗大鼠肺移植后的慢性排斥反应奠定良好的基础。

摘要：背景:研究表明基因工程将成纤维细胞改造为可兴奋细胞是可能的;而真皮成纤维细胞是机体内数量最大的"种子细胞库"。目的:观察肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因共转染真皮成纤维细胞后在心肌梗死部位原位移植对急性心肌梗死大鼠血浆脑钠素浓度和心肌梗死面积的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-03在同济大学附属东方医院细胞治疗室和上海中医药大学动物实验中心完成。材料:雄性SD大鼠60只随机分成正常对照组、心肌梗死对照组、正常移植组和心肌梗死移植组,每组15只。方法:结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。4周后再次开胸在自结扎远端紧靠结扎处,心肌梗死区与非梗死区交界处用微量注射器将100μL经BrdU标记的MyoD/Cx43-FB细胞悬液(细胞数1.0×106)注入左冠状动脉前降支,在结扎远端已缺血的心肌上用同样的针头于靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上多点多位置将另外100μL移植细胞悬液注入到心肌内,深度约4mm;对照组同法等量注入未含细胞的DMEM细胞培养液。主要观察指标:细胞移植前和移植后1d,1,2,4周动态检测血浆脑钠素浓度;同时监测各组大鼠心率、动脉压、左心室内压及左心室等容收缩期室内压最大上升速率和下降速率等血流动力学指标的变化;4周后处死大鼠取心肌标本染色后测定心肌梗死面积。结果:①免疫组织化学检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在。②细胞移植可显著改善心肌梗死大鼠的血流动力学。③心肌梗死对照组和心肌梗死移植组大鼠的血浆脑钠素浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P<0.01);在移植后1d、1周、2周心肌梗死移植组与心肌梗死对照组血浆脑钠素浓度差异无显著性意义,4周后明显降低(P<0.01)。④心肌梗死移植组的梗死面积显著小于心肌梗死对照组(P<0.01)。结论:MyoD和Cx43基因联合转染成纤维细胞后原位移植修复坏死心肌组织,能减小梗死面积。

摘要：背景：利用转基因技术诱导皮肤真皮成纤维细胞分化为特殊器官组织功能的前驱细胞具有重要意义。目的：观察肌肉转录调节因子（myogenic determination，MyoD）基因转染对大鼠真皮成纤维细胞生物学特性的影响。设计、时间及地点：单一样本观察，细胞基因工程学实验，于2005-01／2007—02在同济大学附属东方医院心胸外科和细胞治疗室完成。材料：清洁级雄性SD大鼠6只，购自上海西普尔．必凯实验动物有限公司。Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品，稻瘟菌素粉剂为美国Promega公司产品，慢病毒载体pLenti6／V5-DEST为Invitrogen公司产品，BrdU为美国Sigma公司产品。方法：无菌条件下切取大鼠腹侧全层皮肤，采用200IU／mL的Ⅱ型胶原蛋白酶在4℃下解离大鼠皮肤真皮组织，组织块培养法获取贴壁的真皮成纤维细胞，待生长近融合状态时传代扩增。取传至第3-6代细胞，利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6／V5-DEST-MyoD进行转染，经终浓度为50mg／L稻瘟菌素筛选后，挑选转基因单克隆细胞传代培养，向细胞培养液中加入10μmol／L BrdU于37℃条件下孵育48h。主要观察指标：细胞形态学观察，免疫细胞化学染色鉴定，体外BrdU标记情况。结果：体外分离培养的真皮成纤维细胞纯度高，形态良好，生长增殖功能正常，转染后经稻瘟菌素筛选2周即可见克隆形成。光镜下真皮成纤维细胞免疫细胞化学染色后波形蛋白呈阳性表达，转染MyoD基因后肌动蛋白亦呈阳性表达。10μmol／LBrdU孵育48h的标记率〉98％，且连续传代5次后仍可检测到BrdU阳性细胞。结论：真核表达载体成功介导MyoD基因转染体外分离培养的大鼠真皮成纤维细胞，并诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞，可在体外稳定生长扩增。

摘要：目的采用RNA干扰技术，通过构建表达大鼠髓样分化因子88（MyD88）siRNA慢病毒干扰大鼠肺泡巨噬细胞MyD88g／表达，检测其对细胞功能的影响。方法针对MyD88基因，设计并构建3对siRNA表达质粒，分别与预先构建好表达MyD88N质粒共转染HEK-293T细胞，Westernblot检测MyD88的表达情况，筛选出其中1对干扰效率最高的siRNA，用Gateways方法构建慢病毒干扰载体包装成慢病毒，将慢病毒转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383胞并加入内毒素（LPS）诱导，未转染慢病毒的细胞作为空白对照组和LPS激活组：空白对照组加入与LPS等体积的PBS；LPS激活组加入LPS刺激。ELISA测定各组细胞因子（IL-18、IL-6）释放情况。结果成功筛选出了1对干扰效率最高的siRNA并包装成慢病毒，病毒滴度为2．0×10^6TU／ml。LPS诱导后，与对照组相比．感染慢病毒的NR8383细胞MyD88表达明显受到抑制，IL-1β、IL-6的释放均显著减少，差异有统计学意义。结论慢病毒介导RNA干扰能够有效抑制NR8383细胞MyD88基因的表达，显著减少胞因子的释放，为以抗原提呈细胞（APC）为靶向的体内实验治疗大鼠肺移植相关闭塞性细支气管炎（obliterative bronchitis，OB）的研究提供了手段。

摘要：目的使用Excel软件结合Visual Basic编程工具依据Kaplan-Meier生存分析理论探索肺鳞癌肿瘤组织中MicroRNA-501(miR-501)表达水平对肺鳞癌患者生存时间的影响。方法从Kmplot数据库获取miR-501在不同肺癌患者癌症组织中表达的高低情况数据和对应的生存时间数据,导入Excel表格中。使用Excel软件自带的Visual Basic编程工具设计用户图形界面并编写多个函数进行肺鳞癌患者生存分析。结果肺癌组织中miR-501表达高的肺鳞癌患者生存时间比肺癌组织中miR-501表达低的患者生存时间长。miR-501高表达和低表达的两组患者之间生存曲线的对数秩检验显示,两组生存时间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论使用Excel结合Visual Basic语言编程可以较好地分析miR-501表达高低对肺鳞癌患者生存时间的影响,其结果可信可靠。

摘要：目的探究miR-423-5p调控TGF-β/Smad信号通路对肺癌脑转移模型大鼠的干预作用。方法2019年2月—2020年1月于同济大学附属东方医院转化医学研究中心进行实验。选取SPF级大鼠60只,随机数字表法分为空白组、模型组、上调组、下调组各15只,除空白组外,其余大鼠建立肺癌脑转移模型,建模成功后,上调组、下调组大鼠分别静脉注射miR-423-5p mimics control、miR-423-5p mimics,空白组、模型组大鼠静脉注射等体积生理盐水。干预14 d后比较各组大鼠肺组织病理组织学变化,miR-423-5p表达量,血清癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)、细胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)水平,肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6水平及TGF-β/Smad信号通路蛋白表达量。结果与空白组比较,模型组miR-423-5p表达量、CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平及TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表达量均升高(P均<0.01);与模型组比较,上调组上述指标水平升高,下调组降低(P均<0.01);与上调组比较,下调组上述指标水平均降低(t/P=9.513/0.001、5.936/0.001、5.819/0.001、4.833/0.001、4.465/0.001、7.416/0.001、4.114/0.001、7.320/0.001、6.479/0.001、5.504/0.001、4.880/0.001)。结论下调miR-423-5p可能通过作用于TGF-β/Smad信号通路,调控TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表达量,阻断炎性反应,抑制肺癌脑转移的发生发展。