摘要：目的设计合成及筛选自身免疫关键基因——chl—b（Casitas B-cell lineage lymphoma-b,cbl—b）基因小分子干扰RNA（siRNA）。方法应用RNA设计软件，模拟cbl—b小鼠cbl—bmRNA二级结构，设计并合成针对cbl—bmRNA的4对21核苷酸（nt）siRNA，96孔板转染小鼠淋巴细胞，以空白及转染非特异siRNA（与cbl—bmRNA无同源性的21ntsiRNA）作为对照，应用蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测小鼠淋巴细胞cbl—b蛋白表达。结果cbl—b基因siRNA工作浓度为100nmol／L时转染小鼠淋巴细胞转染率最高，可达（87．48±1．94）％，平均荧光强度最强，可达33．09±1．77。与对照相比，转染cbl—b siRNA的小鼠淋巴细胞蛋白表达明显下调，以siRNA-4最显著，抑制率达85％，转染非特异性siRNA的小鼠淋巴细胞cbl—b蛋白表达水平无明显变化。结论得到cbl—b siRNA转染小鼠淋巴细胞最佳转染条件，成功筛选能高效抑制cbl—b蛋白表达的siRNA-4，其有效抑制时间约为48h，有望通过沉默cbl—b基因直接活化淋巴细胞，增强机体主动免疫杀伤肿瘤细胞。

摘要：目的构建肿瘤血管生成靶向的双靶点RGD10-NGR9超顺磁性氧化铁（USPIO），评价其作为活体磁共振成像（MRI）肿瘤特异性诊断制剂的能力及其成像特点。方法设计合成RGD10-NGR9双靶点杂合肽。采用共沉淀法制备网状交联葡聚糖包覆的USPIO，环氧氯丙烷活化葡聚糖，共价偶联靶向多肽，制备靶向多肽-网状交联葡聚糖-顺磁性氧化铁复合粒子（P—CLN—Dextran—USPIO），并检测其物理性质。采用普鲁士蓝染色和邻菲罗啉比色法检测P—CLN—***体外细胞结合能力。建立裸鼠荷A549瘤模型，评价双靶点RGD10-NGR9-SPIO应用于裸鼠MRI检测的价值。结果成功制备P-CLN—Dextran—USPIO，其中Fe3O4粒径8～10nm左右，Dextran—USPIO的总粒径平均为20nm左右，P—CLN—Dextran—USPIO的总粒径在30nm左右，物理性质稳定。普鲁士蓝染色显示，非靶点USPIO组HUVEC细胞质内未见蓝色铁颗粒，RGD10-USPIO组和NGR9-SPIO组HUVEC细胞质内均可见蓝色铁颗粒，RGD10-NGR9-USPIO组HUVEC细胞质内蓝色铁颗粒最明显。邻菲罗啉比色显示，非靶点USPIO组、RGD10-USPIO组、NGR9-SPIO组和RGD10-NGR9-SPIO组细胞内的铁浓度分别为（1．93±0．35）μmol／L、（4．74±0．76）μmol／L、（5．85±0．48）μmol／L和（10．32±1．22）μmol／L，RGD10-NGR9-USPIO胞内的铁浓度最高，与非靶点USPIO组、RGD10-USPIO组、NGR9-SPIO组差异有统计学意义（均P〈0．05）。裸鼠MRI显示，双靶点RGD10-NGR9-SPIO可以减弱肿瘤部位信号，显著提高肿瘤部位与周围组织之间的病灶对比度噪声比（CNR），较未注射时提高2．83倍（P〈0．05）。结论双靶点RGD10-NGR9-USPIO作为一种阴性造影剂，具有肿瘤新生血管MRI分子成像的应用价值。

摘要：目的构建新型肿瘤血管生成靶向双靶点RGD10-NGR9-超顺磁性氧化铁纳米颗粒，并检测其物理性质。方法设计合成双靶点RGDl0-NGR9杂合肽，以固相合成法异硫氰酸荧光素（FITC）标记杂合肽，检测其与人脐静脉内皮细胞的体外结合能力。采用共沉淀法制备核芯粒径8～12nm的超顺磁性氧化铁，包覆葡聚糖。以环氧氯丙烷活化葡聚糖，共价耦联靶向多肽，制备靶向多肽网状交联葡聚糖一超顺磁性氧化铁复合粒子。采用透射电子显微镜观测粒子大小、x射线衍射仪测试粒子晶型及组成，红外光谱仪分析粒子表面包覆物质表征，纳米粒度仪测定Zeta电位，振动样品磁强计仪测定磁化强度。结果双靶点杂合肽FITC—RGDl0-NGR9与人脐静脉内皮细胞有良好的体外结合能力。成功制备出肿瘤双靶点RGDl0-NGR9-超顺磁性氧化铁，电镜观测近似圆球形，总粒径约30nm。经振动样品磁强计仪测定，70℃时，复合粒子的饱和磁化强度为53．54emu／g，无磁滞现象，有超顺磁性，Zeta电位-60．9mV。结论成功制备出RGDl0一NGR9-超顺磁性氧化铁，其物理性质稳定，具有肿瘤血管生成靶向性。

摘要：目的对外周血造血干细胞活性在深低温(-80℃)下保存3年的效果进行评价。方法对30例经MCS+血细胞分离机采集所得的外周血造血干细胞加入细胞冻存保护剂分别予以-196℃液氮冻存和-80℃冰箱深低温冻存,并检测和比较冻存前后单个核细胞(mononuclear cells,MNC)、CD34+细胞的计数及细胞回收率,细胞活性。结果 -80℃冰箱冻存组MNC、CD34+细胞冻存3年与冻存前比较差异均无统计学意义冻存3年后MNC回收率与冻存1年后比较差异无统计学意义。3年后-80℃冰箱冻存组干细胞与-196℃液氮冻存组比较,差异无统计学意义。结论 -80℃冰箱深低温保存法快速、简便、安全、费用低廉,可有效用于外周血造血干细胞长期保存。

摘要：目的建立前列腺癌组织中胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1,CTHRC1)基因转录水平的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的CTHRC1基因序列设计引物,扩增CTHRC1保守区基因片段,并合成含有该基因片段的PUC57质粒。经2%琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性后,采用PUC57质粒验证ddPCR法的正确度、精密性,并确定检测限及线性范围。采用建立的ddPCR法检测复旦大学附属中山医院泌尿外科住院患者73份前列腺穿刺组织样本(前列腺癌组织40份,非前列腺癌组织33份)中的CTHRC1基因转录水平,同时采用试剂盒检测患者血清中的总前列腺特异抗原(total prostate specific antigen,TPSA)水平,将相应结果进行ROC曲线分析,以获得CTHRC1-TPSA联合检测对诊断前列腺癌的预测概率。结果经2%琼脂糖凝胶电泳验证设计的引物具有良好的特异性。检测值和理论值之间的Log值差异均<1,且拟合度高,R2=0.9959,表明该方法具有良好的正确度;重复性验证CV均<10%,中间精密性验证CV均<15%;该方法的检测限为100copies/μL;检测值在100~104copies/μL范围内,与理论值呈良好的线性相关性,R2=0.9972。ddPCR法检测前列腺癌组织中CTHRC1基因转录水平显著高于非前列腺癌组织(Z=-4.339,P<0.001)。CTHRC1与TPSA联合诊断前列腺癌的ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.847,灵敏度为83.3%,特异性为67.7%。结论ddPCR法可用于前列腺癌组织中CTHRC1基因转录水平的检测,与TPSA指标联合可提高临床诊断前列腺癌的准确性。