摘要：为分析鸭NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)基因和蛋白特性,根据鸭NLRP3基因组序列(Gene ID:101795933)设计引物,经PCR扩增、测序后获得长2 805 bp基因序列,可编码934个氨基酸,包含PYRIN、NACHT和LRR结构域。构建pCAGGS-duNLRP3-Flag真核表达质粒,转染细胞后,蛋白印迹试验检测到约104 ku蛋白,间接免疫荧光试验发现该蛋白在转染后12 h开始表达,弥散分布在细胞质,但经病毒刺激后可在核周发生斑点样聚集。上述结果表明,研究获得了鸭NLRP3基因全长CDS序列,构建的重组质粒p CAGGSduNLRP3-Flag转染DEF细胞后可表达有活性的NLRP3蛋白,为后续鸭NLRP3基因和蛋白功能研究提供参考。

摘要：以浸膏得率、最低抑菌浓度(MIC)值为指标,采用正交设计试验,综合考虑提取方法、溶剂、料液比、提取次数、提取时间、提取温度等5个影响因素,对姜黄等4种具有抗真菌活性中药有效物质提取工艺进行优选。结果优选出的最佳提取工艺分别为:姜黄粗粉(20目)80%乙醇溶液(6倍量),加热回流提取3次,每次2h;射干粗粉(20目)70%乙醇溶液(10倍量),加热回流提取3次,每次2h;栀子粗粉(20目)80%甲醇溶液(6倍量)浸泡0.5h后超声波提取2h;五倍子粗粉(20目)48%乙醇溶液(23倍量),59℃条件下超声提取29min。最佳提取工艺下,姜黄、射干、栀子、五倍子4种提取物浸膏对4株真菌的MIC总值和分别达到31.25,25.00,18.75,18.75g/L,抑菌效果明显且提取工艺稳定可行,值得借鉴。

摘要：优选乌梅等三味具有抗胸膜肺炎放线杆菌活性中药的有效物质提取工艺。以浸膏得率、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)为指标,采用正交设计实验,综合考虑溶剂浓度、料液比、提取次数、提取时间、提取温度等影响因素,对三味中药有效物质提取工艺进行优选研究。优选出的最佳提取工艺为:黄连粗粉70%乙醇浓度(8倍量),加热回流提取2次,每次2 h;乌梅粗粉95%乙醇浓度(10倍量),90℃加热回流提取1次,每次8 h;虎杖粗粉60%乙醇浓度(6倍量),90℃加热回流提取3次,每次2 h。最佳提取工艺下,黄连、乌梅和虎杖三种提取物浸膏对胸膜肺炎放线杆菌的MIC值分别为15.60、10.40、15.60 mg/m L,MBC值分别为26.00、18.20、15.60 mg/m L。

摘要：【目的】了解四川地区新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的分子生物学特征及遗传变异情况。【方法】根据Gen Bank中发表的新型鹅细小病毒的全基因组序列,设计5对兼并引物采用PCR方法分段扩增新型鹅细小病毒四川株的全基因组序列,并利用DNAstar等生物信息分析软件对获得的基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】获得的新型鹅细小病毒四川株(命名为SC16)全长5 109 nt,5′端ITR长408 nt,3′端ITR长407 nt,NS基因长1 884 nt,VP基因长2 199 nt。序列比对和遗传进化分析显示,SC16株与山东分离株SDLC01(KT343253.1)及QH15(KT751090.1)的基因组核苷酸同源性高达99%,与两者的亲缘关系最近,基于NS及VP蛋白的氨基酸序列系统进化树分析结果与此一致。但SC16株的5′端ITR还是发生了一定的变异:与SDLC01及QH15相比,多了几个14 nt的插入片段。【结论】研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料。

摘要：根据Gen Bank公布的四川白鹅T细胞表面分子CD4基因序列设计特异性引物,扩增其胞外去信号肽区基因,将其构建成原核重组表达质粒go CD4-p ET-32a(+),并在大肠杆菌原核表达系统中进行可溶性表达并纯化,为进一步应用与研究提供基础。通过从成年四川白鹅胸腺组织中提取RNA,经反转录合成c DNA为模板扩增CD4基因胞外去信号肽区,并构建原核表达载体go CD4-p ET-32a(+)。在大肠杆菌Rosetta(DE3)p Lys S系统中进行原核表达,通过改变表达温度、培养基、诱导剂IPTG浓度、诱导时间以及抗性浓度等条件,最终获得可溶性表达并经NINTA亲和层析获得纯化蛋白。结果显示,鹅CD4胞外区蛋白只有在16℃的TB培养基中目的蛋白his-go CD4可表达,鉴定结果与预期相符,诱导表达成功且多以不可溶的包涵体形式存在。研究发现改变IPTG浓度对表达产物存在形式影响较大,最终筛选出以0.4 m M的IPTG条件作为可溶性表达的最佳诱导浓度。NI-NTA亲和层析获得纯化蛋白并经Western-blot验证。

摘要：为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。

摘要：为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。

摘要：建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT-PCR-RFLP方法。通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM-E区域部分基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶SpeⅠ消化后于15g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并利用建立的RT-PCR-RFLP方法对78份临床样品进行了JEV的检测及基因型鉴定。结果显示,特异性引物可扩增出长为819bp的片段,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性。经SpeⅠ酶切,基因Ⅰ型JEV RT-PCR产物被切为568和251bp 2个条带,基因Ⅲ型JEV RT-PCR产物被切为446、251和122bp 3个条带,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV混合RT-PCR产物被切为568、446、251和122bp 4个条带,该方法最低可检出1.5pg·μL-1的JEV RNA。RT-PCR-RFLP结果显示78份临床样品中有14份为JEV阳性,其中6份为基因Ⅰ型,8份为基因Ⅲ型,与核苷酸测序分析结果一致。本研究为日本脑炎病毒的实验室诊断及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别提供了一种快速有效的分子生物学方法。