摘要：背景:细胞外基质在肾间质的积聚是肾小管间质纤维化的主要特征。肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化在肾间质纤维化发病机制中起了重要作用。目的:从细胞水平观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的影响。设计:以细胞为观察对象,随机对照实验。单位:四川大学华西医院肾脏科。材料:大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E来源于American Type Culture Collection(ATCC),由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供,本实验所用细胞株为第36代。阿魏酸钠为白色晶体,可溶于水,纯度>98.0%,由成都亨达药业有限公司提供。实验时终浓度分别125,250,500μmol/L。兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白多克隆抗体为武汉博士德产品;ELISA试剂盒为上海森雄公司产品;人重组转化生长因子β1为R&D公司产品;DNA Engine OpticonTM实时荧光定量聚合酶链反应仪为MJ Research产品。方法:将体外培养的细胞株NRK52E分为5组:空白对照组:仅加入含血清的DMEM培养基;转化生长因子β1刺激组:培养液中加入终质量浓度为5ng/L的转化生长因子β1;阿魏酸钠低、中、高浓度组:培养液中加入终质量浓度为5ng/L转化生长因子β1和125,250,500μmol/L的阿魏酸钠。主要观察指标:应用相差显微镜、实时荧光定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附法观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的NRK52E细胞转分化的作用及对细胞外基质主要成分胶原Ⅰ胶原Ⅲ和纤维粘连蛋白的影响。结果:①NRK52E细胞形态:与空白对照组相比,转化生长因子β1刺激组细胞在培养3d后,细胞株NRK52E从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞的形态。阿魏酸钠3个浓度组细胞受转化生长因子β1的刺激而出现的形态学改变得到不同程度的改善,并呈剂量依赖性。②α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达:转化生长因子β15ng/L诱导6h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA较空白对照组上升,在72h达高峰;经过不同剂量阿魏酸钠干预72h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA显著下调并呈剂量依赖性(P<0.05)。③细胞外基质变化:经转化生长因子β15ng/L诱导72h后,细胞培养上清中I型胶原,Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白含量明显增加(P<0.05)。经过不同剂量的阿魏酸钠干预后,不同程度地抑制了转化生长因子β1促I型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白增多的作用,并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:转化生长因子β1可以诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,刺激细胞外基质成分I型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的升高。阿魏酸钠可剂量依赖性地抑制转化生长因子β1所导致的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化作用。

摘要：背景:结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应因子,其异常升高在肾纤维化发生、发展中起关键作用,干预结缔组织生长因子在肾脏的异常表达可改善肾脏的纤维化。目的:从mRNA和蛋白水平观察阿魏酸钠对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织结缔组织生长因子的影响,以及阿魏酸钠干预后大鼠肾间质纤维化的变化,并与氯沙坦进行比较。设计:随机对照动物实验。单位:四川大学华西医院肾脏科和四川大学公共卫生学院。材料:实验选用雄性成年健康SD大鼠24只,购于四川大学实验动物中心(实验用阿魏酸钠片由成都亨达药业有限公司惠赠,批号:050302)。兔抗大鼠结缔组织生长因子多克隆抗体(Santa Cruz)。Western印迹设备购自美国BioRAD,DNA Engine OpticonTM实时荧光定量PCR仪购自美国MJ Re-search公司。方法:实验于2006-05/12在四川大学公共卫生学院医学检验研究室完成(生物安全级别:BSL-1)。将24只大鼠随机分为4组:模型组、阿魏酸钠组、氯沙坦组和假手术组,每组6只。前3组按既往文献方法建立单侧输尿管梗阻模型,假手术行假手术。术后24h开始,阿魏酸钠治疗组予阿魏酸钠溶液150mg/(kg·d)灌胃;氯沙坦组予氯沙坦溶液20mg/(kg·d)灌胃,其余2组灌胃同体积生理盐水。术后14d处死大鼠,取部分肾组织用于分析。主要观察指标:采用荧光定量PCR,Western印迹方法从mRNA和蛋白质水平检测肾组织结缔组织生长因子的表达情况;行HE,Masson染色观察肾间质病理学改变。结果:①阿魏酸钠对肾组织结缔组织生长因子表达的影响:模型组术后14d结缔组织生长因子mRNA和蛋白的表达较假手术组明显升高,而阿魏酸钠治疗组与模型组比较有明显的下降(P0.05)。②阿魏酸钠干预后肾组织病理学改变:单侧输尿管梗阻术后第14天苏木精-伊红染色和Masson染色可见间质中多量炎性细胞浸润和小管、间质的改变,间质胶原的沉积等肾纤维化的病变;单侧输尿管梗阻大鼠经阿魏酸钠治疗治疗后,阿魏酸钠治疗改善了肾组织的纤维化(P0.05)。结论:①阿魏酸钠对单侧输尿管梗阻所致的大鼠肾脏纤维化的形成有明显的抑制作用,其作用机制可能与其降低结缔组织生长因子的表达有关。②阿魏酸钠抑制肾脏纤维化作用与氯沙坦相当。