摘要：为了在活细胞RNA成像中提供更加精准的工具,本文旨在基于broccoli的RNA荧光标记创建荧光强度高、稳定性好的绿色荧光适体.采用理性设计对broccoli进行优化,并通过测定光谱特征和理化性质对broccoli变体进行多轮筛选.结果发现基于对RNA荧光适配体broccoli的三轮突变筛选,获得了荧光强度提升3.3倍的broccoli四位点突变体(命名为Bro);再利用设计的3WJ支架,组建了3WJ-n×Bro RNA荧光适配体家族;采用嵌入串联重复Bro的方式可以显著提升适体的荧光强度,其中3WJ-4×Bro的荧光强度超过3WJ-Bro的2.7倍,且表现出更低的盐离子依赖性和更高的热稳定性、光稳定性和监测灵敏度.结果表明本文设计出的3WJ-n×Bro家族并从中筛选出优异的核酸适配体3WJ-4×Bro,可为在RNA水平上实现活细胞RNA成像提供可视化工具.

摘要：孕期生殖道病原菌感染是威胁妇女和胎儿健康的常见疾病之一,为改进现有检测方法耗时长的缺陷,对基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)的生殖道病原菌快速检测方法进行优化。在Gardnerella vaginalis的LAMP检测体系中,通过对不同环引物组扩增速率(Ct值)进行统计学分析,验证了环引物在LAMP反应中提升扩增速率的能力,同时探究了环引物长度和GC含量对扩增速率的影响,并将其作为环引物筛选参数应用于3种生殖道病原菌(***、Streptococcus agalactiae、Enterococcus faecalis)检测的环引物设计。结果表明,不同GC含量的环引物扩增速率差异不显著,而环引物的长度是影响其扩增效果的关键因素,碱基数较少的环引物有利于提高LAMP反应速率(p<0.05),设计出的引物组GV-1、GBS-132和EF-3可以在105 CFU/mL扩增浓度下在30 min内呈现完整“S”扩增曲线,具有较好的临床病原菌筛查应用潜力。

摘要：猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus,AcCRaV)是侵染猕猴桃的主要病毒之一.为实现对猕猴桃中AcCRaV的快速检测和监控,本研究建立了一种逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)结合横向流动试纸条(LFD)的检测方法,可实现快速、可视化检测猕猴桃中AcCRaV.本研究基于AcCRaV外壳蛋白基因保守区域,设计了一套LAMP特异性引物,优化后的反应体系在62℃恒温条件下,反应60 min,再进行5 min试纸条显色反应,即可完成样品的检测.检测灵敏性实验结果表明,建立的RT-LAMP-LFD方法具有较高的灵敏性,其检测灵敏度是常规RT-PCR的100倍.二者检测结果一致,LFD试纸条实现了检测结果的可视化.总之,该检测方法可为检测猕猴桃中AcCRaV感染状况提供了一种省时、高效的诊断方法.

摘要：植物修复是一种绿色有吸引力的重金属污染修复技术。了解重金属在植物体内不同部位的分布,有助于深入了解重金属植物修复的分子机制。激光诱导击穿光谱技术(LIBS)在元素原位快速分析时拥有突出的技术优势,尤其是具备无需复杂样品前处理、可对固体样品直接分析的突出特点,目前元素扫描成像是LIBS技术的重要研究及应用方向。设计并搭建了基于纳秒脉冲激光器的元素成像LIBS装置,系统光斑分辨率50μm,样品移动步距为100μm,成像分析速度为6.25 mm2·min-1,装置可实现自动化扫描,满足实际分析需求,系统采用多通道平面光栅光谱仪,光谱范围180~800 nm,目标元素光谱经基线扣除,峰面积拟合及归一化处理后绘制分布热图,并以伪彩呈现样品不同区域的元素分布。以豌豆为水培植物模型,利用所搭建的元素成像LIBS装置开展豌豆植株的在体原位元素成像分析,分析了Ni、 Cu、 Cr及Pb重金属在植物体内的差异性分布,并研究了上述四种重金属的吸收途径。结果显示,该元素成像装置可以对植物体内存在的C、 Mg、 Fe、 Ca、 Na、 K等主要基体元素进行有效分析,经过重金属胁迫后,豌豆植物体内存在明显的重金属累积且不同重金属在植株中呈现不同的分布趋势,镍离子在胚轴、胚芽部位大量存在,与镍离子分布不同的是,植株大量吸收铜离子并富集在根部初生结构中;重金属铬在豌豆根的中部和胚芽、胚轴大量积累,而重金属铅则大量富集在胚轴、胚芽中,根尖的含量最少。该研究表明,元素成像LIBS技术可实现对植物体内多种重金属的在体同时分析,这对辅助研究环境水体重金属污染植物修复的机理有意义,同时可为植物生理学和生态毒理学等领域的相关研究提供装置和新方法。

摘要：为研究山桐子遗传多样性,对山桐子转录组数据进行分析,开发SSR分子标记技术.将山桐子高通量转录组测序获得的84 213条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性.通过软件分析,共获得含SSR位点的序列数23 077,出现频率为27.40%,涉及序列数量为29 953条,发生频率为35%.SSR序列中包括1 620种重复基元类型,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为9 782(32.67%)、6 921(23.11%)和5 420(18.10%).单核苷酸中A/T类型比例最高,为9 630(32.15%),二核苷酸和三核苷酸中以类型AG/CT(4 679;15.62%)和AAG/CCT(1 220;1.53%)为主.SSR位点重复次数差别较大,主要是3次(4 748;15.70%),其次为6次(3 707;12.25%)和5次(3 475;11.60%).运用多态性分析的方式初步验证SSR位点在不同地区山桐子标记中的可行性.同时,利用Primer 5.0进行引物设计,随机筛选100对引物进行验证,31对引物可以扩增出条带,19对引物扩增出预期大小的条带,8对引物能特异性区分宜宾、资阳、宁强、成都4个不同地区的山桐子.本研究通过分析山桐子高通量转录组序列的SSR信息,筛选出8对引物验证不同地区山桐子的遗传多样性,将有助于山桐子基因挖掘、分子标记育种和资源保护等后续工作的开展.

摘要：拟南芥PPH1属于蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族,主要参与捕光色素复合物LHCⅡ蛋白去磷酸化调控与光系统的状态转移,与STN7蛋白激酶共同参与调控LHCⅡ的磷酸化与去磷酸化.为了解此酶的具体的催化机制和空间结构,使用生物信息学的方法对PPH1的疏水性、跨膜区、膜体和二级结构进行分析,构建系统进化树并通过同源建模的方法建立其核心结构域的三级结构,围绕蛋白磷酸酶的结构和可能的作用机制关系进行探讨.在以上分析的基础上选择特异位点合成多肽后,免疫家兔并成功制备抗体.蛋白印迹结果显示制备得到了PPH1特异抗体,证实此磷酸酶结构得以正确地预测.研究为今后进一步研究其结构和功能以及突变体的设计提供了理论基础.

摘要：AGC型蛋白激酶在信号通路中占据着极为重要的地位,通过对各种信号通路的调控来影响细胞的生长、增殖和凋亡进程.为方便检测AGC型蛋白激酶的活性,设计并构建了新型AGC型蛋白激酶特异底物GST-Crosstide.通过同位素标记体外磷酸化的方法研究了酵母表达的Pkh1、Ypk1和大肠杆菌表达的Akt1三种AGC型蛋白激酶磷酸化GSTCrosstide的能力.结果显示,酵母表达的有活性的Pkh1和Ypk1均可有效磷酸化GST-Crosstide,并且由于Pkh1对Ypk1的进一步激活,二者共同作用可显著增加GST-Crosstide磷酸化.而仅采用大肠杆菌表达的没有被活化的Akt1则无法磷酸化GST-Crosstide,但Akt1可以被Pkh1或Ypk1激活,从而获得磷酸化GST-Crosstide的能力.研究表明,GST-Crosstide可以作为AGC蛋白激酶活性检测的有效工具,并将有效促进真核生物蛋白激酶调控的细胞信号转导通路的研究.

摘要：NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物中分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉目的.在盐胁迫条件下,T0代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.

摘要：脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.

摘要：本研究从5种培养基中筛选出最适于雨生红球藻HP1藻株绿色细胞生长阶段细胞增殖的培养基,并针对筛选出的培养基分别进行有机碳源和无机碳源及其浓度的优化。在此基础上,以光照强度、初始pH值和诱导时间为实验因素,采用单因素试验、中心点复合设计(CCD)响应面法对雨生红球藻虾青素积累阶段的胁迫条件进行优化。结果表明:HP1藻株在配方A及OHM培养基中均能达到较高生物量,有机碳源和无机碳源的最优浓度均为0.5 g/L。HP1虾青素积累的最优胁迫条件为:光照145μmol/m^(2)·s,初始pH 7.0,诱导时间9 d。在上述条件下,以有机碳源(NaAC)和无机碳源(NaHCO_(3))为碳源的培养体系中,虾青素产量最大分别为5.74 mg/L、4.25 mg/L。研究结果将为进一步提高雨生红球藻虾青素产量提供科学依据。