摘要：为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

摘要：旨在建立快速、简便的兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫直接PCR检测方法。首先克隆斯氏艾美耳球虫线粒体基因组mtDNA和3种兔球虫顶质体基因rpoB,结合GenBank中收录的其它兔球虫的相关序列进行比对分析,然后以种间差异明显的序列为靶基因在其超变区设计多对特异性引物,同时对引物浓度等条件进行优化,并评价PCR方法的敏感性和特异性。本研究首次测定了斯氏艾美耳球虫线粒体基因组全序列和3种兔球虫顶质体基因rpoB的序列,斯氏艾美耳球虫mtDNA全长6277 bp,包括3个蛋白质基因,与其它6种兔球虫mtDNA序列相似率为93.90%~97.45%;斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫顶质体基因rpoB大小在500 bp左右,三者相似性达93.93%~95.30%。靶基因筛选结果表明3种兔球虫ITS与其它基因(rpoB和mtDNA)相比较具有种内保守和种间差异大的特点,更适合用于分子诊断;基于3种兔球虫ITS序列的引物中,Ps1、Pi2、Pm2在单一或多重检测时均具有良好的特异性和敏感性。本试验通过对艾美耳球虫PCR检测候选基因靶标(ITS、mtDNA和rpoB)进行序列分析,筛选ITS为兔球虫种间差异明显的检测靶标基因,在此基础上建立的单一直接PCR方法和多重直接PCR方法具有特异、敏感、操作简便的优点,可用于3种兔球虫的流行病学调查或兔球虫病临床诊断。

摘要：为了建立能够同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR检测方法,本文分别针对各病毒亚型的HA基因高度保守序列设计了3对特异性引物。通过对反应条件的优化,成功建立了在一个反应中同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR诊断方法。根据其敏感性的结果可知,该方法对这3种亚型病毒的最低核酸检测量均为1×10^4拷贝/μL,且该方法特异性良好,具有灵敏、快速、成本低等优点,对禽流感病毒的流行病学调查具有指导意义。

摘要：布鲁氏菌病(简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患疾病,影响了畜牧业的健康发展,甚至威胁到了人类的健康安全,造成了较严重的经济社会损失。因此,对布鲁氏菌病的防控十分必要。本研究主要基于布鲁氏菌保守基因Omp2a,利用在线网站设计3对引物,并优化其反应条件与反应体系,建立了一种检测布鲁氏菌的可视化LAMP方法。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应(PCR)检测方法相比较,并交由陕西省疾病预防控制中心进行实际样本检测。结果表明,基于羟基萘酚蓝(HNB)指示剂,LAMP扩增的结果可凭肉眼观察。建立的LAMP检测方法能准确区分布鲁氏菌与非布鲁氏菌,检测限为2.56×10^(-4) ng/μL。在实际样品检测中,LAMP检测方法相对于常规分离鉴定方法的敏感性和特异性均为100%。因此,本研究建立的LAMP检测布鲁氏菌方法具有特异性强、灵敏度高等优点,扩增45 min即可肉眼观察到检测结果,适用于现场和基层检测。

摘要：为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。

摘要：为进一步开展猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2(登录号:NC001718)的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框(ORF),全长1989bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。

摘要：目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒(FMDV)的一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针;通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;分别以质粒和病毒RNA为模板,构建标准曲线;并进行特异性、敏感性、重复性试验。结果该方法能特异性检测A型、O型、Asia 1型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。结论建立的口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。

摘要：为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR(RT-nPCR)方法。该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍。利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型。实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查。

摘要：根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的基因序列保守区,分别设计了3对引物。通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了检测PEDV、TGEV和GAR的三重RT-PCR方法,并对其灵敏度、特异性进行了检测。该方法的最低检测量分别为PEDV 0.24pg、TGEV 2.3pg、GAR 1.5pg;特异性试验显示,它对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪链球菌2型、猪源沙门菌、空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌等均不产生非特异性扩增。利用该方法对采自四川省6个猪场的46份样品进行检测,结果,PEDV阳性率达76.1%,TGEV阳性率为19.6%,而GAR未被检出;表明同场样品中存在PEDV与TGEV的混合感染。同时用文献报道的单一RT-PCR法对上述样品进行检测,结果符合率均为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较高的灵敏度和特异性,可用于PEDV、TGEV和GAR的检测。

摘要：本实验成功设计并制作出了采用熟胶和橡胶管制成的体积小、硬度适宜、弹性较好、成本低,适合于我国南方地区使用的山羊同期发情的阴道孕酮释放装置(即阴道栓)。