摘要：目的研制一种能同时对18种过敏原特异性IgE进行检测的蛋白芯片,并探讨其在过敏性疾病诊断中的应用价值。方法选择合适的固相载体,经L16(44×23)正交法对芯片制备,并对使用条件进行优化,以Scanarray4000激光共聚扫描仪成像,Quantarray软件分析荧光强度。同时用自制芯片和IVT试剂盒对138份过敏性疾病患者血清进行对比检测分析。结果本研究的最佳试验条件:以用NC膜为固相载体,血清稀释8倍,抗原抗体反应2h,Cy3亲和素浓度为1.25μg/ml。将本研究研制的过敏原特异性IgE检测芯片与IVT试剂盒比较,阳性检出符合率为60.2%,两种方法对鸡蛋、海鱼、大豆、花生、大籽蒿花粉等过敏原的检出率无差异(P>0.05)。结论本研究建立的过敏原特异性IgE检测芯片,具有血清用量少、同时检测多项指标、操作简便、价格低廉等优点,适合在临床检测工作中推广应用。

摘要：目的:比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法:针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果:对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论:与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。

摘要：目的对乙型肝炎(简称乙肝)肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性(RFLP)分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份(65%)标本为野生型,18份(15.7%)标本为YIDD突变,10份(8.7%)标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD存在于6份(5.2%)标本中,YMDD+YIDD存在于4份(3.5%)标本中,2份(1.7%)标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份(85%)标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ2检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P>0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性(P<0.05),用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性(P<0.05)。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。

摘要：研究寡核苷酸芯片的重复性与间隔臂(spacer)和探针长度之间的相关性。设计12条不同长度的带有不同spacer的探针,与749bp荧光标记靶序列杂交。扫描分析三次杂交结果,用Quantarray定量分析软件进行分析。随探针长度的延长,杂交信号的变异系数逐步降低。15mer的探针杂交的信号较弱,杂交不够稳定,重复性也相对较差。20mer、25mer、30mer的探针的变异系数逐渐降低。spacer为15时变异系数最小。说明选择spacer为poly(dT)15的25mer和30mer的探针可以获得较好的重复性。

摘要：目的:利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒。方法:根据序列Blast比对分析结果,设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针。采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA,经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交,杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析。结果:SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号,具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一。结论:寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒。

摘要：目的探讨重组腺相关病毒介导的HDV核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法将针对HBV基因序列C区的反式HDVR z与U6启动子和绿色荧光蛋白基因EGFP及其启动子CMV共同插入腺相关病毒载体pSNAV中并取代其原有CMV启动子区域,构建为pSNAV-CR z重组载体。并将pSNAV-CR z、pSNAV及pLEGFP质粒转染HepG2.2.15培养细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,对转染后培养细胞内蛋白进行HBeAg和HBsAg的ELISA分析。结果所构建的重组载体经双酶切及PCR验证与实验设计一致。重组载体转染培养细胞后,荧光显微计数表明,pSNAV-CR z的转染效率为30%。HBeAg和HBsAg的ELISA检测显示,pSNAV-CR z重组载体对HepG2.2.15细胞中HBV病毒的HBeAg和HBsAg表达抑制率分别为63.5%和50.07%。结论细胞水平试验证明,重组腺相关病毒载体介导的反式HDVR z在体外培养细胞水平对HBV的复制起到一定的抑制作用。

摘要：目的分别构建CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子驱动反式丁型肝炎病毒核酶(HDV核酶)的逆转录病毒表达载体。在这些载体中,HDV核酶设计为靶向HBV基因序列PreS2和C区。方法用PCR技术分别扩增CMV、U2和U3启动子,并连入pMD18-T载体。合成靶向PreS2和C区HDV核酶并利用SalⅠ和H indⅢ的酶切位点分别连入逆转录病毒表达载体pLEGFP(pLEGFP-R z)。然后利用BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点分别把CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子连入重组载体pLEGFP-R z。所有的重组载体经PCR和酶切的方法验证。结果成功地构建了分别含有6种启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体。结论这些重组载体的构建为筛选高效表达核酶的启动子奠定基础。同时这些重组载体也可用于进一步研究HDV核酶抑制HBV复制的效率。

摘要：用响应面法对微球菌DS16发酵生产微生物絮凝剂的条件进行了优化。首先通过Plackett-Burman设计从影响絮凝活性的8个因素中筛选出具有显著活性效应的因素:酵母提取物、液糖、(NH4)2SO4、MnCl2。然后用响应面设计对这四个因素进行优化分析,获得了这几个因素的最佳浓度,确定了发酵培养基的最优配方(g/L):液糖20、K2HPO43、NaH2PO41.8、(NH4)2SO44.3、酵母提取物0.9、MgSO40.2、CaCl20.1、MnCl20.004。利用优化的培养基进行发酵,絮凝活性提高了16.44%。

摘要：目的通过逆转录PCR方法从HDV RNA阳性患者血液中扩增HDV全长基因组。方法从血液中提取病毒RNA,利用HDV序列中较保守的序列设计引物分别扩增得到两个相互交叉的HDV cDNA片段,然后再通过SalⅠ单酶切位点将两个cDNA片段连接成单位长度的HDV cDNA。经过测序、对比分析得到全部HDV基因组序列,并与其他HDV序列进行同源性比对。结果 HDV基因组全长1 677 bp。与基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的序列同源性分别为86%~98%、80%~81%和89%。结论利用RT-PCR的方法可以成功克隆出HDV cDNA序列,通过序列比对可以发现本实验样本为Ⅰ型HDV感染。