摘要：实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas ***20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β-半乳糖苷酶保守片段的DAN序列;根据Marinomonas ***20584天然酶N端氨基酸残基测序结果,设计上游引物,保守DNA片段5'端设计下游引物,克隆N端到保守序列之间的DNA片段;将所得的2个DNA片段拼接并命名拼接后的片段为nbs。根据hiTAIL-PCR方法设计引物,染色体步移克隆nbs上下游片段,拼接上下游片段得到全长序列,设计引物扩增全长片段并测序。本文成功克隆了Marinomonas ***20584菌株β-半乳糖苷酶的编码基因,全长1 971 bp,NCBI比对表明其编码产物为GH-42家族的一个新成员。

摘要：【目的】本研究旨在克隆来自北极海洋、具有合成卤化物潜力的链霉菌(Streptomyces sp.)604F中的一个卤化酶基因,为后续克隆卤化物合成基因簇、分离鉴定卤化物提供指导。【方法】利用琼脂块法初步测试抗菌活性,借助液相色谱-飞行时间串联质谱技术(LC-Tof MS)初步寻找Streptomyces sp.604F发酵粗提液中的卤化物,并以简并PCR扩增合成次级代谢产物的指示基因(I型、II型聚酮合酶及非核糖体多肽合成酶编码基因);根据依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因保守区设计的简并引物,扩增基因片段并测序分析;采用高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)技术扩增卤化酶基因全长。【结果】Streptomyces sp.604F具有较强的抗白色念珠菌活性,其基因组同时含有编码I型聚酮合酶、II型聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因,以及卤化酶基因;通过染色体步移克隆该卤化酶基因全长,共1443 bp,编码一个新的非色氨酸卤化酶,在合成已知卤化物的卤化酶数据库中,与其同源关系最近的为一类参与合成糖肽类次级代谢产物的卤化酶。【结论】Streptomyces sp.604F具有新的非色氨酸卤化酶,且推测参与糖肽类化合物的卤化修饰,为后续寻找目的卤化物提供了指导,也为研究该合成基因簇奠定基础。