摘要：通过正交设计实验综合分析了内充羟丙基甲基纤维素（ＨＰＭＣ）无胶筛分毛细管电泳中的分离场强、ＨＰＭＣ浓度、柱长度和柱内径对核酸分离的影响。结果表明，柱长度越长、柱内径越小、分离场强越小，分离效果越好。考虑实际情况，为能在短时间内使几百个碱基对的核酸得到有效分离，一般选择３７ｃｍ×７５μｍｉ．ｄ．的涂壁毛细管、柱内质量浓度为８ｇ／Ｌ的ＨＰＭＣ、场强为３２４Ｖ／ｃｍ的条件，并在此种条件下分析了ＡｐｏＢ１００基因的低浓度聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增产物（７１０ｂｐ）。采用ＰＣＲ扩增体系作为阴性对照的方法，对未经任何纯化处理的ＰＣＲ扩增产物直接进样，可进行定性测定。

摘要：目的构建稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的干扰素γ(IFN-γ)受体2基因Ifngr2的黑素瘤B16细胞系,进行IFNGR2表达和功能调控研究。方法首先应用http://***/网站设计引导RNA,使用分子克隆的方法构建基于CRISPR-Cas9和CRIS-PITCh(v2)的表达载体,并将2种载体使用LTX共同转染入B16细胞系,筛选单克隆。然后,应用基因组PCR、流式分析以及荧光显微镜技术,对基因敲入位置和基因表达进行分析鉴定。对阳性克隆E10和B4进行IFN-γ20 mg·L-1刺激48 h,分析IFN-γ下游靶基因的表达以检测阳性细胞系对IFN-γ的反应性。最后应用流式分析和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)20 mg·L-1和奥沙利铂2 mmol·L-1处理3和48 h后,E10和B4细胞系Ifngr2和EGFP的表达。结果基因组PCR及测序分析显示,PCR产物与预期一致,EGFP插入基因组正确位置。流式细胞分析及荧光显微镜观察分析,可看到绿色荧光峰值右移及绿色荧光,说明该细胞系正常表达EGFP。RT-PCR分析显示,IFN-γ刺激后,Cd274(PDL1)在阳性克隆E10和B4细胞中显著上调63和138倍,Psmb9显著上调2885和4616倍,上调幅度与B16母细胞相当,说明E10和B4细胞系具有正常的IFN-γ信号通路。流式细胞分析显示,TNF-α处理后,E10和B4细胞平均荧光强度由3845和4456上升到5720和5972;奥沙利铂处理后,E10和B4细胞平均荧光强度由3032和2786上升到4285和4179。RT-PCR分析显示,TNF-α刺激后,Ifngr2在B16,E10和B4细胞中分别上升11.40,9.31和21.39倍,EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.50和5.37倍;奥沙利铂刺激后,Ifngr2在B16,E10和B4细胞中分别上升10.99,3.54和5.39倍,EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.70和2.44倍。IFN-γ处理不能上调Ifngr2和EGFP的表达,因此绿色荧光强度反映了Ifngr2的表达。结论成功构建稳定敲入EGFP标记的Ifngr2基因的黑素瘤细胞系,发现TNF-α和奥沙利铂可上调Ifngr2和EGFP的表达,表明该细胞系可用于IFNGR2表达和功能研究。

摘要：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）是近年来活跃在生化分析领域中的一支新军，它以其在生物大分子如蛋白质、核酸、多糖测定中准确、灵敏、快速及操作简便、价格便宜等优势倍受生物化学家的青睐。其实，早在１９５５年Ｗｉｌｅｙ和Ｍｃｌａｒｅｎ［１］就已设计出了飞行时间质谱仪，进行了大量研究小分子结构的工作。直到８０年代，ＨｉｌｌｅｎＫａｍｐ教授应用固体基质进行基质辅助激光解吸附电离，同时，飞行时间质谱仪器的分辨率及瞬时离子检测的时间分辨率得到了根本的改善后，从而使基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪获得了新生，如雨后春笋般地蓬勃发展起来。与传统的磁式质谱仪相比，它的特点有：１．可实现纳秒量级的瞬时记录，经过多次瞬时记录累加得到的质谱图，其信噪比得到了极大的改善。２．具有高的离子流通率，因而获得高的灵敏度，仅需ＰＭ数量级样品即可测定。３．原则上没有质量范围限制，目前可测定蛋白质的质量数已超过１００ＫＤ。４．外标法测定的误差小于０．２％，是传统的测量蛋白质质量方法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳法所无法比拟的。５．与磁质谱仪相比，结构简单，价格便宜。我国的赵善楷教授［２］已成功地自行研制了这种仪器。

摘要：目的建立多重PCR和纳米孔测序相结合的检测方法,为实现消化道病原体现场高灵敏度快速检测奠定基础。方法通过设计消化道病原体特异性引物,验证引物特异性,优化多重PCR扩增条件,构建快速建库测序体系,对病原体的检测灵敏度进行评价。结果建立的12种消化道病原体多重PCR检测体系可以对所有靶序列进行有效扩增。经测序检测,当引物池中每条引物浓度为0.1μmol/L时,12种病原体混合DNA模板和3种轮状病毒A、B、C的混合RNA样品检测灵敏度均可达到103拷贝/ml。结论该方法可在短时间内完成消化道病原体的鉴定,提升突发公共卫生事件中现场病原体检测效率,有望在疫情防控中发挥重要作用。

摘要：目的通过对多重PCR扩增条件的优化和纳米孔测序中病原微生物检测特异性及灵敏度的评价,建立一种由多重PCR和纳米孔测序技术相结合的检测技术体系,满足对呼吸道病毒现场快速检测鉴定的需求。方法首先针对呼吸道病毒设计特异性引物,其次优化PCR扩增条件,建立快速测序体系,最后对不同浓度的病原体进行扩增与测序鉴定,评价检测体系的灵敏度。结果优化后的多重PCR检测体系在退火温度为55℃、引物添加浓度为0.1µmol/L时,可同时检出25种呼吸道病毒,检测灵敏度可达1×104拷贝/ml,整体检测时间在4 h以内。结论该方法简单快捷,能够实时获取扩增片段的序列信息,特异性强,灵敏度较高,有望为呼吸道病原体的快速筛选和现场检测鉴定提供有力技术支撑。

摘要：目的　建立防止产物污染的UDPE(UDG -DuplexPCR -EIA)技术 ,用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法　选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR(FerricUptakeRegulator)基因为靶序列 ,设计两对引物进行PCR扩增 ,用UDG(尿嘧啶糖基化酶 )防止PCR产物污染 ,并用微孔板杂交 -酶联显色检测扩增的PCR产物片段 ;用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果　该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌 ;对于纯DNA模板 ,检测灵敏度可以达到 10fg/ μl;对于系列稀释菌液提取的模板 ,灵敏度可达 0 1个菌 / μl;对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为 10个菌 / μl,10 0个菌 / μl和 10 0个菌 / μl;检测系统可以防止 10 9个PCR产物分子的污染 ;检测系统可以在 37℃下稳定保存 7d。结论　本研究建立了稳定的 ,防止产物污染 。

摘要：构建并鉴定UBXN1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统建立稳定干涉细胞系并进一步研究UBXN1的功能。将携带不同特异性干涉序列的DNA片段插入PLKO.1载体中构建慢病毒表达载体,并制备慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染U2OS细胞,建立稳定干涉细胞系,应用real-time PCR和western blot技术分别检测U2OS细胞中UBXN1 mRNA和蛋白质水平的表达差异。重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,western blot检测证实设计的五条shRNA干扰序列有效的敲低U2OS细胞中内源性UBXN1的表达。成功制备UBXN1的慢病毒干涉颗粒,并建立UBXN1稳定下调的U2OS细胞系。

摘要：本文评述了当前细胞凋亡研究中存在的普遍问题和主要热点领域 ,并重点论述了半胱天冬酶 - 3( caspase- 3)和 Bcl- 2之间的相互关系 ,对细胞凋亡调控研究的现状以及以凋亡机制中关键性蛋白为靶标的新药设计等热点领域最新进展 .

摘要：在原核表达中影响外源基因表达效率的因素有很多,这其中翻译起始效率起了非常重要的作用。翻译起始效率又主要受SD序列、SD序列与起始密码子之间的间距、DB(DownstreamBox)序列、mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构和稀有密码子等因素的影响。主要针对DB序列和5′端稀有密码子的优化设计了软件。通过计算机对序列进行分析比对后,按照匹配碱基数、匹配位置、密码子使用频率平均值的顺序进行排序,给出一些优化序列,并给出了软件算法。

摘要：目的研究重组人干细胞因子血小板生成素(SCFTPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物,利用RTPCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合新策略将其融合成SCFTPO融合基因,克隆到pGEMT载体中,构建pET32a/SCFTPO融合基因原核表达载体,在宿主菌***21(DE3)plysS中经异丙基βD硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCFTPO,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测。目的蛋白经包涵体变性,金属螯合层析纯化,透析复性,用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCFTPO融合基因的高表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。Westernblot法鉴定表达正确,MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性,浓度为100ng/ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCFTPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。